6-硝基-4-芳氨基喹啉化合物的合成及体外抗肿瘤活性研究

刘 丹，薛艾奇，李 雪，栾 天，汪海峰，张昕旸

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

酪氨酸激酶表皮生长因子受体(EGFR)及其家族成员HER2是靶向癌症治疗的公认靶点[1].自20世纪80年代以来，当EGFR和HER2被提出作为潜在的抗癌靶点时，小分子激酶抑制剂已成为抑制EGFR和HER2激酶活性最具潜力的手段.迄今为止在美国食品和药物管理局(food and drug administration,FDA)批准用于靶向癌症治疗的抑制剂中，拉帕替尼(lapatinib，A)和埃罗替尼(erlotinib，B)属于4-苯氨基喹唑啉结构(见图1)，治疗非小细胞肺癌或乳腺癌中发生的EGFR/HER2依赖性肿瘤[2-3].Pawar等[4]在4-苯氨基喹唑啉化合物的研究基础上合成一系列6-取代-4-苯氨基喹啉衍生物(C，见图1)，证明以喹啉为母核的化合物同样具有较好的细胞毒活性；大量学者[5-8]在喹啉环的6位适当引入吸电子基，提高了化合物对HER家族的多重抑制作用，进而避免了耐药性的产生.课题组曾设计并合成了一系列7-氟-4-苯氨基喹啉化合物[9]，部分化合物表现出较好的抗肿瘤活性.

图1 酪氨酸激酶抑制剂Fig.1 Tyrosine kinase inhibitors

本文参考以上喹唑啉及喹啉化合物的构效关系，以喹啉为母核，在喹啉的6位连接硝基，4位上引入芳氨基，共合成4个6-硝基-4-芳氨基喹啉化合物(6a～6d)，并以SGC-7901、BEL-7402和A549细胞为靶细胞，测定其体外抗肿瘤活性.合成路线及目标化合物结构如图2所示.

图2 目标化合物的合成路线Fig.2 Synthetic route of target compounds

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

X-4型数字显微熔点测定仪,北京泰克仪器有限公司；ZF-7三用紫外分析仪，上海顾村电光仪器；Thermo-Finnigan LCQ型质谱仪，美国热电-菲尼根公司.

吉非替尼(gefitinib，质量分数99 %)，齐鲁(海南)制药公司；RPMI1640 DMEM 培养基及胰酶，Gibeco公司；胎牛血清，北京鼎国生药技术有限责任公司；溴化四氮唑盐、蛋酶K和小牛血清蛋白，Sigma 公司；SGC-7901细胞、BEL-7402细胞和A549细胞，中科院上海细胞库；其余所用试剂均为分析纯或化学纯.

1.2 合成

1.2.1 2-((4-硝基苯氨基)亚甲基)丙二酸二乙酯(1)的合成

取5.64 g(26.07 mmol)EMME与3.00 g(21.73 mmol)4-硝基苯胺置于三颈瓶中加入30 mL的正丁醇，回流搅拌反应6 h，反应结束.将剩余物中加入无水乙醇，冷却结晶，过滤，干燥后得5.82 g淡黄色针状固体1，收率86.92 %，mp 141.91～142.23 ℃.

1.2.2 4-羟基-6-硝基喹啉-3-羧酸乙酯(2)的合成

将40 mL的联苯-苯醚(质量比为1∶3)加入100 mL的三颈瓶中，磁力搅拌下加热至250 ℃，将2.00 g(6.51 mmol)化合物1分批并缓慢加入联苯-苯醚中，250 ℃下反应1 h.冷却至室温，加入40 mL石油醚，析出固体.过滤，滤饼用石油醚洗涤，干燥得1.32 g白色固体2，收率76.63 %，mp 352.54～352.81 ℃.

1.2.3 4-羟基-6-硝基喹啉-3-乙酸(3)的合成

在100 mL三颈瓶中加入1.02 g(3.90 mmol)的化合物2与质量分数10 %的氢氧化钠溶液30 mL，搅拌下回流反应4 h.冷却至室温，用盐酸调pH至1，析出白色固体，抽滤，滤饼用水洗至中性，干燥后得0.85 g白色固体3，收率92.72 %，mp 284.54～286.43 ℃.

1.2.4 4-羟基-6-硝基喹啉(4)的合成

三颈瓶中加入0.50 g(2.17 mmol)化合物3和50 mL联苯-苯醚试剂，240～250 ℃下反应1 h，冷却至室温，加入50 mL石油醚，析出固体.抽滤，滤饼用石油醚洗涤，得0.32 g黄色固体4，收率91.44 %，mp 323.73～325.24 ℃.

1.2.5 4-氯-6-硝基喹啉(5)的合成

将0.30 g(1.58 mmol)化合物4溶于5 mL 三氯氧磷中，滴加1滴N，N-二甲基甲酰胺(DMF)后，于80 ℃下反应3 h，冷却至室温，将反应液缓慢倾倒在冰水中并不断搅拌，用饱和NaHCO3溶液调节pH至3，抽滤，滤饼水洗至中性，得白色固体，硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯(体积比为5∶1)，得0.28 g白色固体5，收率85.42 %，mp 142.21～142.84 ℃(文献值[8]mp 144～145 ℃).

1.2.6 6-硝基-4-(4′-硝基苯氨基)喹啉(6a)的合成

将100 mg(0.48 mmol)化合物5，73.12 mg(0.53 mmol)4-硝基苯胺，38.00 mg(0.48 mmol)吡啶溶于30 mL异丙醇中回流，反应结束.减压蒸除异丙醇，冷却至室温，加入10 mL乙醚、10 mL饱和NaHCO3溶液，室温搅拌0.5 h，抽滤，滤饼用水洗至中性，硅胶柱色谱纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯(体积比为5∶1)，得117.10 mg黄色固体6a，收率78.53 %，mp 219.91～220.53 ℃，MS(ESI)，m/z:311.82{[M+H]+}.

1.2.7 6-硝基-4-(2′-氨基苯氨基)喹啉(6b)的合成

化合物6b是由化合物5与2-氨基苯胺所得，制备方法如同化合物6a.黄色固体，收率79.13 %，mp 234.32～235.71 ℃，MS(ESI)，m/z:281.73{[M+H]+}.

1.2.8 6-硝基-4-(2′，3′，4′-三氟苯氨基)喹啉(6c)的合成

化合物6c是由化合物5与2，3，4-三氟苯胺所得，制备方法如同化合物6a.黄色固体，收率82.64 %，mp 210.52～211.74 ℃，MS(ESI),m/z:320.71{[M+H]+}.

1.2.9 6-硝基-4-(吡啶-3-亚甲基苯氨基)喹啉(6d)的合成

化合物6d是由化合物5与3-氨甲基吡啶所得，制备方法如同化合物6a，但不加乙醚.黄色固体，收率81.52 %，mp 198.94～200.22 ℃，MS(ESI),m/z:281.14{[M+H]+}.

1.3 体外抗肿瘤活性筛选

采用MTT法检测4个6-硝基-4-芳氨基喹啉化合物对人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞BEL-7402和非小细胞肺癌细胞A549的体外抗肿瘤活性，选用吉非替尼作为阳性对照[10-11].3种细胞株均培养于含有10 %(体积分数)胎牛血清的RPMI 1640培养基中.用胰酶使细胞脱壁，以每孔5×103个细胞的密度种植在96孔板中，置于含5 %(体积分数)CO2的37 ℃恒温箱中培养过夜.然后将不同质量浓度(0.4 mg/L，1.2 mg/L，3.6 mg/L，11 mg/L，33 mg/L)的待测目标化合物以每孔20 μL的量加到96孔板中，并设置3个复孔，在恒温箱中孵育48 h.之后在每孔中加入新配置的MTT溶液，在37 ℃恒温箱中继续孵育4 h.每孔加入100 μL的DMSO使甲瓒完全溶解，用酶标仪在490 nm处测定各孔光密度(OD)值，计算所测目标化合物对肿瘤细胞的抑制率.IC50为48 h后抑制细胞数量为50 %的药物浓度.

2 结果与讨论

2.1 合成

在合成化合物1时，最初选用乙醇作为溶剂[12]，由于硝基有强吸电诱导效应和共轭效应，使得硝基苯胺的氨基N原子的亲核能力降低，因此，选用沸点较高的正丁醇代替乙醇作为溶剂，回流反应，升高温度有利于反应的进行，与乙醇作溶剂相比反应时间大大缩短，通过TLC监测完全反应只需6 h.

2.2 体外抗肿瘤活性

体外抗肿瘤活性筛选结果见表1.由表1可知:化合物6a(喹啉环4位苯氨基上连接硝基)对SGC-7901和BEL-7402细胞无活性，但对A549有较强的抑制活性(IC50为9.32 μmol/L)，且活性优于吉非替尼(IC50为 14.77 μmol/L)；化合物6b(喹啉环4位苯氨基上连接氨基)对3种细胞均无抗肿瘤活性；化合物6c(喹啉环4位苯氨基上连接3个氟原子)对BEL-7402和A549细胞无活性，对SGC-7901细胞有较好的抑制效果(IC50为15.04 μmol/L)，活性与于吉非替尼相当(IC50为 14.08 μmol/L)；化合物6d(喹啉环4位为吡啶基)对SGC-7901和A549细胞均无活性，而对BEL-7402细胞有中等抑制作用(IC50为 49.77 μmol/L).

表1 目标化合物对人体癌细胞的体外抗增殖活性Table 1 In vitro anti-proliferative activity of target compounds against human cancer cell lines

3 结 论

实验设计并合成了4个未见报道的6-硝基-4-芳氨基喹啉化合物，测定了其对SGC-7901、BEL-7402和A549细胞的抗肿瘤活性.化合物6a对A549细胞的抑制效果最好，IC50为9.32 μmol/L，活性优于阳性对照药吉非替尼；化合物6c对SGC-7901细胞的抑制效果较好，与吉非替尼活性相当，IC50为15.04 μmol/L；6-硝基-4-芳氨基喹啉化合物进一步衍生化研究、抗肿瘤活性及构效关系研究正在进行中.