基于Wnt/β-catenin信号通路探讨去毒附子汤对骨关节炎大鼠的软骨保护作用

陈祖祥 葛彦志 周莉 王春雷 陈俊杰 童培建 单乐天 刘福存

1.浙江中医药大学第一临床医学院 杭州 310053 2.浙江省肿瘤医院 3.海军军医大学附属长征医院

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是骨关节炎（osteoarthritis，OA）的常见类型，是最常见的一种关节炎性疾病[1-4]，影响滑膜和关节，导致疼痛及关节僵硬，使患者日常活动、运动和工作受限，严重降低患者的生活质量[5]。KOA是一种多因素性疾病，累及整个关节，包括软骨、骨和滑膜[6-7]。现代医学治疗轻、中度KOA的方案主要有生活方式改变、运动疗法以及药物疗法，药物疗法包括服用非甾体类抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS）、 类固醇激素关节腔内注射、关节内粘弹性物质氨基葡萄糖补充疗法[8-11]。以上疗法各有其优缺点，NSAIDS因其胃肠道并发症而限制了长期应用，而类固醇激素关节腔内注射及氨基葡萄糖补充疗法在临床上仍有争议，因此当前尚未发现理想的治疗方法，也无法针对KOA的病因进行治疗。

中医认为，KOA属“骨痹”“历节”范畴，乃风寒湿三气痹阻关节所致[12-13]。张仲景在《伤寒杂病论》中应用大量篇幅阐述了风寒湿邪痹阻关节的传变及治疗，并确立了理法方药。附子汤首见于《伤寒论·辨少阴病脉证并治》，主论阳虚有寒导致的关节疼痛，有云：“少阴病，身体痛，手足寒，骨节痛，脉沉者，附子汤主之。”前期研究中发现，去毒附子汤（detoxicated Fuzi decoction，FZT）中的君药去毒附子具有抗炎镇痛作用，并且可以调节关节软骨代谢[14-15]，但是FZT治疗KOA的作用机制尚不明确。既往国内外研究发现多种信号通路与KOA发生密切相关，其中包括Wnt/β-连环蛋白 （Wnt/β-catenin）信号通路和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路等[16]。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活能显著减少软骨细胞外基质分泌，抑制软骨细胞分化[17]。因此本研究拟从Wnt/β-catenin信号通路切入，通过构建KOA大鼠模型，并且采用血清药理学、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、实时定量聚合酶链式反应（Real-time quantitativepolymerase chain reaction，Real time-qPCR）及Western blot等方法，初步探索FZT治疗KOA的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雌性无特殊病原体（specific pathogen free，SPF）级SD大鼠40只，8周龄，体质量（180±20）g，购于上海西普尔必凯实验动物有限公司[实验动物生产许可证号码：SCXK（沪）2018-0006]，饲养于浙江中医药大学实验动物中心全封闭SPF环境中 [实验动物使用许可证号码：SYXK（浙）2018-0012]。 室温25℃，相对湿度40%～60%，每日光照12h，自由摄食和饮水。本研究经过浙江中医药大学动物伦理审查 （决议编号：ZSLL-2017-091）。

1.2 主要试剂 Trizol、逆转录试剂盒购于Takara公司（批号：AHF1813A、AI40832A）；SYBR Green购于Bimake公司（批号：B21202）；碘乙酸（monoiodoacetate，MIA）购于Sigma-Aldrich公司（批号：I4386）；β-actin、Wnt、糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β） 和β-catenin抗体购于Cell Signaling Technology公司（批号：#3700S、#2721、#5676、#8480）；卷曲关联蛋白（frizzled-related protein，FRZB）抗体购于Abcam公司（批号：ab205284）；低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（low density lipoprotein receptor related proteins 5/6，LRP5/6） 抗体购于Novusbiologicals公司（批号：NBP1-45687）；番红O-固绿（safranine O-fast green，SO）染色液购于Sigma公司（批号：HT90432）；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA）购于Solarbio公司（批号：E8030）。

1.3 主要仪器 ScopeA1型光学显微镜购于德国ZEISS公司；37370足底热辐射测痛仪购于意大利UGO BASILE公司；YLS-3E电子压痛测定仪为安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司产品；SW-CJ-1F层流超净工作台购于苏州安泰空气技术有限公司；100μm细胞筛、CO2细胞培养箱均为美国Thermo公司产品。

1.4 方法

1.4.1 FZT的制备 全方由去毒附子12g、茯苓9g、人参6g、白术12g、白芍9g等药组成，上述饮片均由浙江中医药大学中药饮片厂提供。先按前期方法制备去毒附子提取物[14-15]，将浓缩的去毒附子提取液加入其他药材，加入约10倍量水，提取2次，每次0.5h，减压浓缩成含有生药2g·mL-1的药液。根据等效剂量系数折算法计算药品稀释浓度[18]，得到FZT终浓度为：低剂量2.4g·kg-1，中剂量4.8g·kg-1（相当于临床用药剂量），高剂量9.6g·kg-1。

1.4.2 FZT含药血清的制备 选择10只SD大鼠随机分为空白血清组和FZT含药血清组，每组5只。FZT含药血清组给予中剂量FZT灌胃，空白血清组给予相同剂量的0.9%氯化钠溶液灌胃，每天灌胃2次，连续7d。于末次灌胃2h后，大鼠腹腔注射麻醉，无菌条件下心脏采血，4℃保存2h后，3 000r/min离心10min，取上层血清，56℃水浴灭活，以0.22μm微孔滤膜滤过除菌，-80℃保存备用。

1.4.3 动物处理

1.4.3.1 分组与造模 将其余30只大鼠随机分为正常组，模型组，FZT低、中、高剂量组，每组6只。除正常组外，其他各组采用关节腔注射MIA的方法造模，以3%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，麻醉满意后，剃去膝关节局部被毛，消毒后固定大鼠并屈曲膝关节，将浓度为40mg·mL-1的MIA 50μL微量注射至关节腔内。

1.4.3.2 干预方法 MIA注射1周后进行疼痛行为学检测，造模后的大鼠疼痛阈值显著降低即造模成功[19]。造模成功后开始灌胃给药，FZT低、中、高剂量组分别以2.4、4.8、9.6g·kg-1FZT灌胃，模型组和正常组以同剂量的0.9%氯化钠溶液灌胃，均为1次/d，连续4周。

1.4.4 疼痛行为学检测 首次给药前和末次给药后，对各组大鼠进行疼痛行为学检测。

1.4.4.1 压痛检测 固定待测大鼠，放松其腿部，采用电子压痛测定仪的感应探针刺压大鼠足趾区域，待一定压力下大鼠出现挣扎抬腿，暂停刺压并记录压力强度。重复检测3次后取平均值，为压痛阈值。

1.4.4.2 热痛检测 将待测大鼠置于独立小室中，使其自由活动直至安静状态，而后启动底部的加热仪，观察大鼠足部动作，一旦足部收缩立即停止，记录反应时间。重复检测3次后取平均值，为热痛阈值。

1.4.5 原代软骨细胞分离培养 将3周龄左右的SD大鼠处死，无菌条件下剪取双侧股骨头及膝关节，以75%乙醇充分浸泡，剔除关节周围的肌肉和肌腱组织，打开关节腔，削取软骨组织块，置入无菌培养皿。加入磷酸盐缓冲液 （phosphate buffer saline，PBS）充分漂洗，进而将软骨块剪碎至lmm3大小，滤干后置入盛有0.2%的Ⅱ型胶原酶的广口瓶中，于37℃恒温震荡箱中消化，40min后将上层消化液转移至15mL离心管中，800r/min离心5min，收集底部细胞，再加入含10%胎牛血清的杜尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）制成细胞悬液，过滤后计数。 调整细胞密度为2×105个·mL-1，置于CO2细胞培养箱中培养。

1.4.6 组织病理学观察 末次给药后1周，过量麻醉处死各组大鼠，剪取膝关节并剔除多余肌肉组织，浸入甲醛溶液中固定。1周后取出，用水冲洗干净，再以EDTA制备的脱钙液进行脱钙。待关节组织变软后，依次完成脱水、包埋、切片和SO染色，光镜下观察，并分别参照Mankin评分标准[20]进行评分：（1）形态评分：形态正常为0分，表面不规则为1分，关节出现血管翳为2分，关节出现血管翳和软骨表面不规则为3分，软骨表面存在裂隙为4分，软骨深部存在裂隙为5分，钙化带存在裂隙为6分；（2）软骨细胞评分：软骨细胞形态和数量正常为0分，弥漫性软骨细胞增多为1分，局部软骨细胞增多为2分，软骨细胞过少为3分；（3）软骨基质染色评分：染色区域正常为0分，染色区域轻度减少为1分，染色区域中度减少为2分，染色区域重度减少为3分，病理切片未着色为4分；（4）潮线完整性评分：潮线完整为0分，潮线被血管破坏为1分。评分总分为0～14分，由2人以上进行双盲评分。

1.4.7 MTT检测FZT对软骨细胞增殖活力的影响 将软骨细胞以4×105个·mL-1的密度接种于96孔板中，每孔加入Iscove改良的杜尔伯克培养基（Iscove's modified Dulbecco's medium，IMDM）100μL，贴壁培养24h后移除培养基，将细胞分为空白组、MIA组、干预组，其中空白组加入空白培养基100μL，MIA组加入MIA100μL，干预组在MIA组基础上加入不同浓度的FZT含药血清 （2.5%、5%、10%、15%、20%），分别培养24、48、72h。 每个时间点向每孔中加入MTT溶液10μL，37℃孵育4h后再加入二甲基亚砜150μL，酶标仪上检测450nm吸光度（absorbance 450，A450），重复操作3次。

1.4.8 Real-time qPCR检测相关mRNA的表达 将软骨细胞分为NC组、TNF-α组、TNF-α+FZT组。其中，TNF-α组、TNF-α+FZT组均采用10ng·mL-1的TNF-α预处理6h，TNF-α+FZT组使用10%的FZT含药血清处理24h，其余两组使用空白培养基处理24h。各组细胞处理完成后加入氯仿剧烈振荡，静置5min后12 000r/min离心15min，取上清液并加入等量异丙醇，混匀后静置10min，再以12 000r/min离心10min，去上清液，75%乙醇清洗，干燥沉淀后，加入RNase-free水溶解，提取总RNA。使用All-in-one cDNA反转录试剂盒合成cDNA，再用SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒检测软骨2型胶原（collgen type 2，Col2）、10型胶原（collgen type 10，Col10）、 基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP13）、带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素与金属蛋白酶4（adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4，Adamts4）、带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素与金属蛋白酶5（adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs5，Adamts5），Wnt/β -catenin信号通路相关因子FRZB、Wnt、LRP5/6、GSK-3β、β-catenin的mRNA表达，以2-ΔΔCt计算结果表示各目的基因相对表达量。引物由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成。见表1。反应总体系为20μL，反应条件为：95℃变性5min，循环重复95℃变性10s，60℃退火和延伸30s，共40个循环。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4.9 Western blot检测相关蛋白的表达 细胞分组和处理同1.4.8。收集细胞，去掉培养基，以PBS洗涤2次后加入细胞裂解液，冰上裂解30min，超声破碎15s，离心收集上清液，以聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）试剂盒检测蛋白浓度，取等浓度样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresi，SDS-PAGE），转膜后封闭2h，洗膜后分别加入Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β和β-catenin一抗 （稀释比例：1:1 000），4℃过夜，洗膜后加入二抗（稀释比例：1:10 000），化学发光试剂（electrochemiluminescence，ECL）显色与定影。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示。组间总体比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用最小显著性差异法（least significant difference，LSD）检验，两两比较均采用students-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠疼痛行为学结果比较 各组间总体比较，大鼠的热痛阈值和压痛阈值差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.01）。 与正常组比较，模型组大鼠的热痛阈值和压痛阈值显著降低（P＜0.01，P＜0.01）；FZT灌胃干预后，FZT低、中、高剂量组大鼠的热痛阈值和压痛阈值较模型组显著提高 （均P＜0.01），并靠近正常水平。见图1及表2、3。上述结果表明，FZT低、中、高剂量对MIA造成的KOA关节疼痛有显著缓解作用。

表2 各组大鼠压痛阈值比较（±s，g）Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold in each group（±s，g）

表2 各组大鼠压痛阈值比较（±s，g）Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold in each group（±s，g）

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01Note:Compared with normal group，##P＜0.01;compared with model group，**P＜0.01

组别n 造模后第4周正常组 6 267.61±33.57模型组 6 132.89±26.61##FZT 低剂量组 6 224.33±13.31**FZT 中剂量组 6 241.20±29.80**FZT 高剂量组 6 259.40±21.20**

表3 各组大鼠热痛阈值比较（±s，s）Tab.3 Comparison of thermal withdrawal latency in each group（±s，s）

表3 各组大鼠热痛阈值比较（±s，s）Tab.3 Comparison of thermal withdrawal latency in each group（±s，s）

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01Note:Compared with normal group，##P＜0.01;compared with model group，**P＜0.01

组别n 造模后第4周正常组 6 11.50±1.27模型组 6 4.83±1.05##FZT 低剂量组 6 8.07±1.35**FZT 中剂量组 6 9.91±1.20**FZT 高剂量组 6 10.90±1.00**

图1 各组大鼠疼痛行为学结果比较Fig.1 Comparison of pain-related behavioral results in each group

2.2 各组大鼠KOA的组织病理学结果比较 SO染色提示，正常组大鼠关节软骨表面光滑、形态完整，基质内细胞排列整齐、分布区域均匀、层次清晰，未见软骨细胞肥大性退变，软骨下骨小梁区域正常，无断裂或减少。模型组大鼠关节软骨出现明显缺损和形态破坏，随处可见降解的软骨基质，软骨细胞大量丢失，可见典型的肥大性退变。FZT各剂量组中，关节软骨改善明显，FZT低剂量组关节存在少量软骨细胞，但仍有肥大化趋势，较模型组改善明显；FZT中剂量组关节软骨可见许多正常形态软骨细胞，软骨基质逐渐恢复正常；FZT高剂量组关节软骨基本恢复正常，可见大量正常形态软骨细胞，软骨基质染色充分。见图2。Mankin病理评分表明，模型组较正常组显著增高（P＜0.01），FZT各剂量组评分较模型组显著降低（均P＜0.01）。见图3。

图2 各组大鼠关节组织病理学观察（SO染色，100×）Fig.2 Histopathological observation of rat joints in each group（SO staining，100×）

图3 各组大鼠关节组织Mankin评分比较Fig.3 Comparison of Mankin's scoring of rat joints in each group

2.3 各组软骨细胞增殖活力比较 MTT结果提示，加入FZT含药血清共培养24、48和72h后，大鼠软骨细胞增殖活力显著增强，浓度从2.5%增加至20%，促增殖作用明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。作用24h和48h后，10%的FZT含药血清促增殖作用最强，随着浓度增加，促增殖作用趋于平稳。见表4。因此本研究后续实验采用10%的FZT含药血清进行干预。

表4 各组大鼠软骨细胞增殖活力比较（%，±s）Tab.4 Comparison of proliferative activity in each group（%，±s）

表4 各组大鼠软骨细胞增殖活力比较（%，±s）Tab.4 Comparison of proliferative activity in each group（%，±s）

注：与同时点2.5%含药血清比较，◆P＜0.05；与同时点5%含药血清比较，◇P＜0.05Note:Compared with 2.5% drug-containing serum at the same time，◆P＜0.05;compared with 5% drug containing serum at the same time，◇P＜0.05

含药血清浓度 给药后24h 给药后48h 给药后72h 2.5% 4.97±4.55 3.38±3.31 7.60±2.90 5% 11.32±3.70◆ 8.57±2.49◆ 15.31±4.01◆10% 19.48±5.01◆◇ 12.57±3.49◆◇ 23.60±3.02◆◇15% 19.40±6.60◆◇ 12.43±2.72◆◇ 27.70±6.92◆◇20% 19.24±4.03◆◇ 11.30±4.07◆◇ 27.91±2.91◆◇

2.4 各组大鼠软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达比较 与NC组比较，TNF-α组软骨细胞Col10、MMP13、Adamts4、Adamts5、Wnt、LRP5/6、GSK-3β以及β-catenin显著上调，而Col2显著下调（均P＜0.01）；经10%的FZT含药血清干预后，上述基因的mRNA表达变化均被显著逆转（均P＜0.01），而软骨细胞FRZB的mRNA表达略有下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。 见图4。

图4 各组细胞Col2、Col10、MMP13、Adamts4、Adamts5、FRZB、Wnt、LRP5/6、GSK-3β、β-catenin的mRNA表达比较Fig.4 Comparison of mRNA expression of Col2，Col10，MMP13，Adamts4，Adamts5，FRZB，Wnt，LRP5/6，GSK-3β and β-catenin in each group

2.5 各组大鼠软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达比较 与NC组比较，TNF-α引起软骨细胞Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β和β-catenin的蛋白表达水平显著上调（均P＜0.01）；经FZT含药血清干预后，上述蛋白表达均显著下调（均P＜0.01）。见图5。

图5 各组细胞Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β和β-catenin蛋白表达比较Fig.5 Comparison of protein expression of Wnt，LRP5/6，FRZB，GSK-3β and β-catenin in each group

3 讨论

0A是以关节软骨变性、破坏，滑膜炎症，骨赘形成和软骨下骨硬化为基本病理改变的疾病，主要临床表现为慢性关节疼痛、关节僵硬、肿胀、畸形、活动受限等。在世界范围内的所有成人关节病中，膝关节已经成为OA最好发的部位[21]。研究提示，一生中罹患KOA的概率是14%，45岁以上的人群中40%患有不同程度的OA[4]。随着人口的老龄化趋势的上升和肥胖率的增加，可以预料，如果KOA的治疗水平不能够得到相应的提升，那么KOA将对医疗系统和社会经济造成沉重的负担[4]。由于相关发病机制尚不清楚，因此目前临床上对于KOA的治疗手段非常有限。

近来研究表明，多种信号通路与KOA的发生密切相关，其中包括Wnt/β-catenin信号通路和TGF-β信号通路等。在大多数关节炎中都存在Wnt/β-catenin信号通路异常激活，Wnt/β-catenin信号通路可能参与了关节组织中软骨细胞、成骨细胞和滑膜细胞的功能调控[22]。在Wnt/β-catenin经典信号通路中，分泌型的配体蛋白Wnt与膜表面受体蛋白FRZB结合后，激活胞内蓬乱蛋白（dishevelled，DVL）[23]。DVL通过抑制GSK-3β等蛋白形成的β-catenin降解复合物的活性，从而可以稳定细胞质中游离状态β-catenin蛋白的水平。细胞质中稳定积累的β-catenin进入细胞核后，与T细胞因子淋巴样增强因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）转录因子家族结合，启动下游靶基因如原癌基因c-myc、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）等的转录[24]。Wnt-7a通过抑制2型胶原蛋白和蛋白聚糖的合成，能够促使关节软骨去分化，并且抑制其凋亡[16]；Wnt-5a和Wnt-5b通过对Cyclin D1和p130的调节，能够促进软骨细胞增殖，而推迟其分化[17]。βcatenin在成骨细胞中广泛表达，可与关节形成必需的转录因子Y染色体性别决定区-盒转录因子9（sex-determing region of Y chromosome-box transcription factor 9，SOX9）相关联，而SOX9的功能是抑制βcatenin的活性从而调节软骨细胞分化[25]。Hill等[26]研究表明，β-catenin在成骨细胞前体中有自我修复功能，Wnt/β-catenin信号通路是防止成骨细胞向软骨细胞分化所必需的。综合以上研究的结果，笔者推测抑制Wnt/β-catenin信号通路可能是治疗KOA的有效途径。

祖国传统医学的认识中，OA属于 “痹症”“骨痹”范畴，其病因可分为内外两端。《素问·痹论》曰“风寒湿三气杂至，合而为痹”“痹者，重感于风寒湿之气也”。《膝骨关节炎中医诊疗专家共识（2015年版）》将KOA主要证型归纳为：气滞血瘀、寒湿痹阻、肝肾亏虚、气血虚弱四个证型，其中又以寒湿痹阻证较为多见[27]。中医学认为患者体质素虚，腠理空疏，营卫不固，风寒湿邪乘虚侵袭人体，导致气血运行受阻，进而产生疼痛、肿胀、屈伸不利等一系列症状，是本病的根本病机[27]，所以针对KOA的中医治疗多以祛邪扶正为主。

中医对附子汤的应用始于《伤寒论》，有云：“少阴病，身体痛，手足寒，骨节痛，脉沉者，附子汤主之。”方中用附子温肾以扶真阳之本，用人参大补元气以扶后天之虚，加茯苓、白术健脾利水化湿，又以芍药以制术、附之温燥以护阴，且配苓、术助疏泄以利水。历代医家认为本方重在温补元阳、以散寒湿，将其誉为“温补第一方”。现代药理学研究显示，以上5味药的药理活性成分均具有镇痛、抗炎等作用[28-32]。刘毅等[33]以附子汤从少阴辨证治疗寒湿型类风湿关节炎80例，结果治愈7例、显效25例、有效39例，总有效率为88.8%。由此证实，附子汤具有治疗KOA的临床应用价值。

疼痛是KOA患者的主要症状，减轻和消除疼痛是临床治疗的主要目标之一[34-35]。KOA疼痛的发病机制复杂，滑膜炎症是其主要的原因[36]。滑膜炎症是OA的重要特征，表现为滑膜增厚，渗出增多，导致关节肿胀，是造成炎性疼痛的主要成因[37]。在本研究中，采用MIA关节腔注射制备KOA大鼠模型，1周后疼痛行为学显示模型组大鼠的压痛和热痛阈值较正常组显著降低，这表明KOA大鼠模型成功建立。在此基础上，进一步进行FZT干预。干预第4周后，FZT低、中、高剂量组大鼠的热痛和压痛阈值较模型组均显著提高，提示FZT能提高KOA模型大鼠的疼痛阈值，而且作用效果可能与剂量有关，但是其具体机制仍需进一步探讨。

软骨损伤是OA最主要的病理改变。杨帆[38]研究表明，KOA兔模型的软骨结构紊乱，层次不清，表层软骨出现剥脱且表层细胞减少，局部软骨细胞簇集，潮线消失。本研究中，模型组软骨出现典型的KOA样病变，FZT各剂量组软骨虽有少量软骨细胞肥大，但与模型组比较，均有一定程度的改善和修复。同时Mankin评分也说明FZT能够改善软骨退变的表现，而且其作用可能与剂量有关。

胶原酶诱导的Col2降解和蛋白聚糖酶诱导的聚集蛋白聚糖的降解是OA的早期病理标志[39]。MMP13作为主要的胶原酶，而Adamts4/5作为主要的聚集蛋白聚糖酶，在OA进展过程中能够降解软骨中的Col2和聚集蛋白聚糖[40-41]。Col10是OA中晚期软骨细胞肥大标记物，OA由于软骨细胞肥大和钙化，导致Col10水平上调，与OA患者不同程度的软骨退化和炎症有关[42]。在OA的发展过程中，促炎细胞因子如TNF-α，通过激活软骨细胞分解代谢参与软骨降解，KOA患者滑液中TNF-α的浓度升高也已得到证实[43]。因此，本研究应用TNF-α处理的软骨细胞作为KOA样体外模型，并进行细胞和分子实验，以评估FZT对KOA的治疗机制。本研究结果证实，TNF-α可以上调Adamts4/5、MMP13、Col10的表达并下调COL2的表达，FZT含药血清可以逆转上述改变。进一步研究发现，TNF-α可以激活Wnt/β-catenin信号通路，破坏软骨，促进降解；FZT含药血清则可以降低Wnt、LRP5/6、GSK-3β和β-catenin的 mRNA表达和Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β和β-catenin蛋白的表达。FRZB在干预前后虽然mRNA水平没有变化，但是在蛋白水平上则显著改变，这可能是由于检测时间点的不同，也可能是由于转录过程中的降解以及翻译过程中的调控和修饰[44]，导致了mRNA和蛋白表达水平的差异，这些需要进一步研究。

综上所述，FZT能有效改善KOA大鼠的疼痛症状，防止软骨退化，其分子机制与Wnt/β-catenin信号通路有关。本研究为FZT治疗KOA的临床应用提供了科学依据，也为FZT的临床安全应用和二次开发奠定了基础。同时，由于KOA的发病机制复杂，涉及病变部位不止软骨，还有滑膜与软骨下骨等，所以需要进一步的研究来阐释FZT治疗KOA的机制，这对于了解KOA的发病机制和开发治疗KOA的药物具有重要意义。