芪山配方颗粒治疗肥胖湿热蕴脾证及其对肠道菌群-免疫炎症途径的影响

魏燕 金剑虹 王雁秋

浙江中医药大学附属杭州市中医院 杭州 310007

肥胖是指体重超过标准体重20%，而单纯性肥胖是指全身脂肪分布比较均匀，不伴有内分泌激素紊乱，主要由遗传因素和营养过剩所致的肥胖。单纯性肥胖占肥胖人群的95%左右。当进食热量多于人体消耗量，而以脂肪的形式储存于体内，脂肪细胞数量和体积增大，就会逐渐发展为单纯性肥胖。近年来，随着人们生活方式的变化，肥胖的发病率迅速增长[1]。因为肥胖、超重导致的慢性代谢紊乱以及由此引发的糖尿病、心脑血管病、肿瘤、不孕不育、焦虑抑郁等疾病的患病率也逐年攀升[2-5]，因此迫切需要寻求合理有效的干预措施。目前的减肥治疗药物，大都存在有效应答率低、副作用大、停用后体重反弹等诸多问题[6]；而调整饮食与运动相结合的治疗方式往往难以长期坚持，依从性差[7]。寻找有效治疗单纯性肥胖的药物或方法成为近年来的研究热点。

目前认为，肠道菌群在调节免疫炎症和糖脂代谢方面发挥着重要作用[8]。有研究发现，单纯性肥胖患者肠道菌群的组成及其代谢产物紊乱，可影响免疫细胞如辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）和调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的生成和分化，从而导致慢性低水平免疫性炎症和肥胖的发生[9-12]。目前，多项研究显示中药对肠道菌群具有重要影响，小檗碱、葛根芩连汤等中药成分或中药组方均具有改善菌群失调的作用[13-14]。芪山配方颗粒由葛根芩连汤化裁而来，该方系结合中科院仝小林院士和我院国家级名老中医郁加凡的经验所创。前期研究结果显示，芪山配方颗粒对糖尿病前期患者具有降低血糖、改善胰岛素抵抗、降低体重的作用[15-16]，但作用机制尚未明确，且对单纯性肥胖人群未作研究。因此，本研究将探索芪山配方颗粒治疗单纯性肥胖湿热蕴脾证的疗效，以及对肠道菌群-免疫炎症途径的影响，以期为中药治疗肥胖提供参考。

1 资料和方法

1.2 一般资料 采用随机双盲安慰剂对照前瞻性研究的方法，将2019年1月1日至12月31日就诊于浙江中医药大学附属杭州市中医院的80例单纯性肥胖患者，按随机数字表法分为中药组和对照组，每组各40例。本研究通过院内伦理审查（伦理编号：2018KY038），所有患者均签署知情同意书。两组患者血压、体质量指数（body mass index，BMI）和糖化血红蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。 见表1。

表1 两组患者一般资料比较Tab.1 Comparison of general information in each group

1.3 纳入标准 同时满足以下要求者，予以纳入：（1）符合《肥胖症基层诊疗指南（2019年）》[17]的单纯性肥胖诊断标准：男性腰围≥90cm，女性≥85cm；且BMI≥28kg/m2；（2）年龄25～50岁；（3）参照《中医内科常见病诊疗指南中医病症部分》[18]中肥胖症相关内容，中医辨证分型属于湿热蕴脾证：脘腹胀满，食少倦怠，头重如裹，便溏不爽，小便色黄，及全身湿热黄疸征象，舌质胖大，舌苔黄腻，脉滑数；（4）停用影响体重药物4周；（5）患者自愿参与研究，并签署知情同意书。

1.4 排除标准 满足以下任何一条者，予以排除：（1）因药物、内分泌疾病或其他疾病导致的体重增加；（2）合并严重的肝肾功能障碍或其他严重原发性疾病；（3）6个月内有急性心脑血管事件或心肌梗死病史；（4）应激状态、继发性高血糖或继发性高血压；（5）一年内接受过减重手术；（6）4周内有抗生素应用史；（7）不能配合饮食控制，或不按规定用药等拒绝合作者；（8）精神疾病或肿瘤患者；（9）妊娠或哺乳期女性，及计划妊娠或无避孕计划的女性；（10）可能对受试药物过敏者；（11）已接受药物治疗的糖尿病患者。

1.5 治疗方法

1.5.1 中药组 给予芪山配方颗粒口服，芪山配方颗粒1包/次，2次/d，疗程12周。芪山颗粒配方为葛根15g、黄芩10g、黄连10g、大黄3g、绞股蓝10g、生黄芪15g、淮山药15g、苍术15g、茯苓15g、炒枳实10g、生山楂15g、川芎10g，由本院中药制剂室生产。其他干预措施包括饮食调整、运动等，均予低脂糖尿病饮食，配合每日50min的有氧运动。

1.5.2 对照组 给予安慰剂口服，安慰剂1包/次，2次/d，疗程12周。安慰剂配方为淀粉、色素、味素，由本院中药制剂室生产。其他干预措施同中药组。

1.6 观察指标 每4周观察患者临床症状，并检测空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、血脂、血压、腰臀比、BMI、体脂含量、中医症状积分等指标。第0周和第12周检测HbA1c、 空腹胰岛素 （fasting insulin，FINS）、血清IL-17、TNF-α水平、Th17/Treg比例和粪便肠道菌群，以及肝肾功能、血常规、尿常规、心电图。

1.6.1 菌群数量及组成测定 将定量的肠道排泄物梯度稀释后接种于亚硫酸铋琼脂（bismuth sulfite agar，Bs）培养基厌氧培养48h，分离双歧杆菌；以类杆菌-胆汁-七叶苷琼脂（bacteroides-bile-escinagar，BBE）培养基厌氧培养24h，分离脆弱拟杆菌；以乳酸菌选择性培养基厌氧培养24h、肠球菌琼脂需氧培养24h，分离肠球菌；以FS培养基厌氧培养72h，分离梭杆菌；以KF链球菌琼脂培养基厌氧培养24h，分离链球菌；以伊红美蓝琼脂培养基需氧培养24h，分离大肠杆菌。待菌落长出后，以菌落形态、革兰染色、生化反应鉴定所需目的菌。在不同的培养基上，对菌落进行菌种鉴定。

1.6.2 荧光定量聚合酶链式反应（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）分析肠道菌群数量变化 以无菌方法收集患者的粪便1g，置于EP管中，按试剂盒说明书提取粪便基因组DNA。根据双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、拟杆菌、梭杆菌、链球菌16S rDNA基因序列，设计相应菌属PCR引物，并在BLAST基因库内比对引物序列相应菌属的特异性。取对照组各细菌的PCR产物，按DNA纯化试剂盒说明进行纯化，测定纯化产物吸光度（absorbance，A）值及浓度，换算为各标准品1μL的拷贝数，用于标准曲线的制作。

1.6.3 生化指标检测 FPG、血脂等生化指标均由本院Olympus 2000大型全自动生化仪测定；FINS、HbA1c由本院ADVIA Centaur® XP全自动化学发光免疫分析仪测定。

1.6.4 流式细胞仪检测Th17/Treg细胞比例 采集两组患者的外周血，静置1h，4℃下2 000r/min离心10min，收集并分装血清，-20℃保存备用。加入抗人CD3-PECY7单克隆抗体和抗人CD4-PE单克隆抗体各0.5μg，振荡混合均匀后，避光室温孵育30min。30min后洗涤，3 000r/min离心5min，以预冷的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤后，流式细胞仪分别测定Th17/Treg细胞比例。

1.6.5 血清IL-17、TNF-α水平检测 采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清IL-17、TNF-α的水平。 采集两组患者的外周血，静置1h，4℃下2 000r/min离心10min，收集并分装血清，-20℃保存备用。加入1mL经过稀释的固定、透膜剂，反应50min后，用透膜缓冲液洗涤并重悬，再加入异硫氰酸荧光素标记的抗人IL-17单克隆抗体或叉头框蛋白p3（forkhead box protein p3，Foxp3）阳性的抗原递呈细胞单克隆抗体（同时设同型对照反应管），采用ELISA测定血清IL-17、TNF-α的水平，具体操作严格参照ELISA试剂盒说明书进行。

1.7 疗效判定标准 临床痊愈：中医临床症状、体征消失或基本消失，证候积分比例减少≥90%且体重减轻≥15%；显效：中医临床症状、体征明显改善，证候积分比例减少≥70%且＜90%，体重减轻≥10%且＜15%；有效：中医临床症状、体征均有好转，证候积分比例减少≥30%且＜70%，且体重减轻≥5%且＜10%；无效：中医临床症状、体征均无明显改善，甚或加重，证候积分比例减少＜30%或体重减轻＜5%。证候积分比例（%）=（治疗前证候积分-治疗后证候积分）/治疗前证候积分×100%，总有效率（%）=（临床痊愈例数+显效例数+有效例数）/总例数×100%。

证候积分计分方法：脘腹胀满计1分，乏力倦怠计1分，头重如裹计1分，便溏不爽或大便干结计1分，小便色黄计1分，食欲旺盛计1分，口苦口臭计1分；舌质胖大计2分，舌苔黄腻计2分，脉滑数计2分。

1.8 统计学分析 应用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以±s描述，符合正态分布的计量资料组内比较采用配对样本t检验；若符合正态且方差齐的计量资料组间比较采用两独立样本t检验，符合正态但方差不齐，则采用两独立样本t'检验。等级资料采用非参数秩和检验（Kruskal-Wallis检验）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者脱落情况统计 中药组脱落2例，1例因工作调动于入组后第5周脱落，1例因家庭住址搬迁于入组后第9周脱落；对照组脱落2例，1例因合并上呼吸道感染使用抗生素于第5周脱落，1例因疗效欠佳而不愿再配合观察于入组后第5周脱落。脱落患者使用临床试验意向性分析，脱落者数据采用失访前最后一次测量结果。

2.2 两组患者临床疗效比较 治疗后中药组总有效率达80%，对照组总有效率52.5%，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。 见表2。

表2 两组患者临床疗效比较（例）Tab.2 Comparison of clinical efficacy in each group（cases）

2.3 两组患者治疗前后生化指标比较 与治疗前比较，对照组患者治疗后各组指标变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）；中药组患者治疗后FPG、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、BMI、体脂含量、HbA1c、FINS、腰臀比和中医证候积分均显著低于治疗前，高密度脂蛋白水平高于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗后组间比较，中药组患者治疗后FPG、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、BMI、体脂含量、HbA1c、FINS、腰臀比和中医证候积分均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表3。

表3 两组患者治疗前后生化指标比较Tab.3 Comparison of biochemical indexes in each group before and after treatment

2.4 两组患者治疗前后肠道菌群数量比较 与治疗前比较，对照组患者治疗后乳酸菌和脆弱拟杆菌、双歧杆菌的菌落数量高于治疗前，而肠球菌和大肠杆菌菌落数量低于治疗前，但差异无统计学意义（P＞0.05）；中药组患者治疗后乳酸菌和脆弱拟杆菌、双歧杆菌的菌落数量均显著高于治疗前，肠球菌和大肠杆菌菌落数量显著低于治疗前，差异均有统计学意义（P＜0.05）。治疗后组间比较，中药组患者治疗后乳酸菌和脆弱拟杆菌、双歧杆菌的菌落数量高于对照组，而肠球菌和大肠杆菌菌落数量低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。FQ-PCR检测各粪便细菌拷贝数也发现相似的结果。见表5。

表4 两组患者治疗前后肠道菌群数量比较（cfu·g-1）Tab.4 Comparison of number of intestinal flora in each group before and after treatment（cfu·g-1）

表5 两组患者治疗前后粪便细菌拷贝数比较（Log10 copies/g）Tab.5 Comparison of number of copies of fecal bacteriain each group before and after treatment（Log10 copies/g）

2.5 两组患者治疗前后炎症指标比较 与治疗前比较，对照组患者治疗后炎症指标均未见明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）；中药组患者治疗后IL-17、TNF-α、Th17水平及Th17/Treg比例均显著低于治疗前，Treg水平高于治疗前，差异均有统计学意义（P＜0.05）。治疗后组间比较，中药组患者治疗后IL-17、TNF-α、Th17水平及Th17/Treg比例均低于对照组，Treg水平高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 见表6。

表6 两组患者治疗前后炎症指标比较Tab.6 Comparison of inflammation indexes in each group before and after treatment

2.6 不同Th17/Treg比例患者肠道益生菌总量比较 根据中药组患者的Th17/Treg比例进行分组，将Th17/Treg比例＜0.5的患者作为低水平组，Th17/Treg比例＞0.5的患者作为高水平组。低水平组患者治疗后益生菌总量明显高于高水平组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 见表7。

表7 Th17/Treg高水平组与低水平组患者肠道益生菌总量比较（cfu）Tab.7 Th17/Treg comparison of total intestinal probiotics between high-level and low-level group（cfu）

3 讨论

关于肥胖的病因，早在《黄帝内经》中就有阐述。《素问·奇病论》曰：“此肥美之所发也，此人必数食甘美而多肥也。肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴……治之以兰。”明确指出饮食不节是引起肥胖的重要原因，肥胖最终导致消渴病的发生，而具有健脾化湿作用的药物如兰草可以治疗肥胖。

笔者认为，胃强脾弱、肠化无权是肥胖的主要病因病机。胃强则胃火旺盛，消谷善饥，嗜食肥甘；脾弱则脾失健运，中焦壅滞，痰湿内生，脾不散精，精化为浊，壅而为脂；肠化无权，则清浊不分，糟粕不降，甚则上承，积而为膏。胃为水谷之海，主受纳腐熟水谷；脾主运化，为胃行其津液，二者相辅相成。《素问·经脉别论》云：“饮入于胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精。”《素问·厥论》曰：“脾主为胃行其津液也。”脾主运化，主升清，布精微，将葡萄糖、蛋白质、脂肪等精微物质输布于五脏，而充养四肢百骸，故胃纳正常、脾气健运、升降有序、精归正化则气血阴阳平衡，反之则痰湿膏浊内生，腹胀脘痞，形态肥胖。故胃强脾弱之意为胃的腐熟功能亢奋，而脾的运化功能无力，表现为消谷善饥，兼大便溏泻。脾与胃相表里，经过胃初步腐熟的饮食物适时下降到小肠，经小肠分清泌浊，清者借脾气升清布达五脏六腑，充养四肢百骸，浊者借其通降之性下输阑门而入大肠。清浊各走其道，食物才得以充分消化吸收，气调血畅。若小肠功能失司，化物无权，清浊不分，此时并非脾虚无法布散精微，而为小肠载浊上承，亦或但壅肠道，与新入饮食相杂一团，精浊相掺，脂膏不分，无力化物。

芪山配方颗粒由葛根芩连汤合六君子汤加减而成，主以健脾化湿、养阴清胃、升清降浊。方中生黄芪、淮山药、绞股蓝、茯苓补益脾气、健脾化湿；黄连、黄芩大苦大寒，胃气得苦寒则降，胃火得苦寒则消；葛根味辛性凉，能升发脾阳而鼓舞脾气上行，使津液输布以达到生津止渴之功，脾气升胃气降，则大气一转，运化自如；大黄泻热通腑，枳实、山楂理气消食、化痰消积，苍术芳香化浊，使腑气得降、糟粕得泻；川芎为血中之气药，作为佐药，行气活血，使周身气血调畅。去掉葛根芩连汤原方中甘草，其目的在于防止血糖升高和水钠储留而导致的体重增加。全方使脾气健运而水津四布，清痰浊内热，消肥甘中满。本研究发现，经芪山配方颗粒干预后不仅可以降低患者体质量，改善血糖、血脂、血压等生化指标，而且能够改善脘腹胀满、乏力倦怠、头重如裹、便溏不爽或大便干结、小便色黄、食欲旺盛、口苦口臭、舌质胖大、舌苔黄腻、脉滑数等临床症状。

研究证实，肠道菌群组成的差异与肥胖症的发生关系密切，其机制主要与激活炎症反应、促进能量吸收、调节肠道通透性等有关[19-20]。还有研究表明，肥胖症患者常伴随炎症信号通路的激活、免疫细胞浸润等病理改变[21]。因此，本研究从肠道菌群-免疫炎症途径入手，探索芪山配方颗粒改善单纯性肥胖的机制。结果提示，芪山配方颗粒可以调节肠道菌群，促使双歧杆菌、脆弱拟杆菌、乳酸菌等肠道益生菌增加，大肠杆菌和肠球菌等有害菌群数量减少。

现代药理研究也发现，芪山配方颗粒的组成药物可影响肠道菌群。何旭云等[22]研究发现，生黄芪主要成分黄芪多糖能够显著抑制小鼠肥胖，并明显调节肠道菌群。同时多项研究指出，葛根、黄芩、黄连、淮山药、川芎、茯苓、黄芪等均能够影响肠道菌群的组成和丰度[23-26]，从而进一步证实了芪山配方颗粒对肠道菌群的影响。

肠道菌群对免疫细胞的平衡具有重要的调控作用。方骞等[27]研究发现喘息型支气管炎患儿粪便双歧杆菌/大肠杆菌比例与Treg/Th17比例呈直线正相关关系。另有研究提示，小檗碱能够调节大鼠的肠道菌群结构以及Th17/Treg细胞平衡[28]。而Th17细胞与Treg细胞之间平衡的破坏是很多免疫、代谢性疾病发病的关键因素[29-30]，因此本研究进一步检测了芪山配方颗粒对炎症细胞及炎症因子的影响。结果显示，中药组患者IL-17、TNF-α水平和Th17/Treg比例均显著降低，表明芪山配方颗粒能够影响单纯性肥胖患者体内的炎症反应。进一步探讨Th17/Treg水平和肠道菌群关系发现，发现Th17/Treg低水平患者肠道益生菌总量显著高于Th17/Treg高水平患者，表明单纯性肥胖患者肠道益生菌数量和Th17/Treg比例存在关联。因此可以推测，芪山配方颗粒可能通过提高单纯性肥胖患者肠道菌群丰度和多样性而抑制炎症反应，从而改善肥胖症状，而此作用可能与调节Th17/Treg比例有关。

综上所述，本研究发现芪山配方颗粒能够通过影响肠道菌群的构成和丰度，从而调节Th17/Treg比例及炎性因子水平，减轻单纯性肥胖湿热蕴脾证患者临床症状，起到重塑体型、改善生化指标的作用，并最终达到治疗肥胖的目的。然而本研究仍有不足之处，后续仍需进一步探究芪山配方颗粒发挥功效的主要成分以及肠道菌群影响体内炎症反应的机制。