睾丸支持细胞发育与血睾屏障形成的微观结构

郑 鹏，冯 瑞，秦 雪，李 琦，王春安

（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江昇太牧业发展有限公司，黑龙江兰西 151500）

睾丸曲细精管是雄性动物产生配子（精子）的器官，在曲细精管内主要有支持细胞和生殖细胞组成［1-2］。在动物生长发育过程中，支持细胞逐渐发育成熟，形成血睾屏障，使曲细精管内维持一个精子发生的特殊内环境，生殖细胞逐渐分化形成生殖干细胞、不同类型的精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞、精子［3-4］。初情期后，曲细精管内的结构和功能已经基本完善，生精上皮处于不同发育阶段的生精细胞不断分裂，源源不断产生精子。但初情期前，支持细胞形成血睾屏障和生殖干细胞的迁移、增殖与分化的机制还不是很清楚。

为此，本试验选取不同日龄的民猪睾丸，通过制作组织学切片和免疫荧光染色，研究支持细胞发育和血睾屏障形成的形态学变化，为猪睾丸生殖生理的研究和应用提供理论和实践依据，同时为民猪公猪保种提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验动物及采样

7，30，60，70，90，110日龄民猪，来源于黑龙江昇太牧业发展有限公司兰西县民猪保种场。猪保定后，用碘酒消毒下腹部，无菌取出双侧睾丸，剪去脂肪垫，用37℃生理盐水冲洗睾丸。取睾丸组织小块，迅速放入固定液中固定。固定液包括4%甲醛-PBS和pH值为7.2的2.5%戊二醛。

1.2 光学显微镜的组织学观察与测量

取睾丸组织小块，迅速放入4%甲醛-PBS固定液中固定，24 h后用纱布包好，编号，按照常规的石蜡切片步骤制作切片［5］，对组织切片进行全切片扫描，然后使用CaseViewer 2.4 RTM切片图像处理软件进行观察及测量。

1.3 电子显微镜的组织学观察

将样品放入pH值7.2的2.5%戊二醛中固定，并置于4℃冰箱中保存24 h。然后按照常规的电子显微镜切片步骤制作切片：PBS冲洗—四氧化锇固定—PBS冲洗—乙醇逐级脱水—丙酮置换—环氧树脂浸透—包埋—切片。用ULTRACUT-E型超薄切片机切片，切片厚度为5 000～7 000 nm。用柠檬酸铅、醋酸双氧铀在25℃下对切片染色40 min，用双蒸水冲洗干净后放入培养皿中待检。电镜切片的观察与显微摄影采用Mic H-7650型电子显微镜［2-3］。

1.4 免疫荧光染色

将载玻片上的切片用二甲苯及梯度乙醇处理，接着置于0.1 mmol/L的EDTA（pH值9.0）中，88℃处理10 min，以修复抗原。处理好的切片用2%BSA在37℃条件下封闭30 min，每张切片加200μL稀释到适当浓度的第一抗体（1∶500，兔抗多克隆抗体Connexin-43、Occludin、ZO-1、KRT-18），37℃孵育1 h，PBS洗3次。每张切片加200μL稀释的第二抗体（1∶200，红色荧光标记的羊抗兔IgG抗体），室温孵育40 min，PBS洗3次。荧光显微镜下观察及拍照［6-7］。

2 结果

2.1 民猪睾丸的光镜组织学观察

7日龄民猪睾丸：曲细精管直径为58～60μm，每个切面有20～23个支持细胞、1～3个生殖细胞。支持细胞呈圆形，附着在基膜上，细胞核呈圆形或椭圆形，生殖细胞处于向基膜迁移的状态，有的生殖细胞已经附着到基膜上，细胞着色较浅，细胞形态明显大于支持细胞，细胞质偏向基膜生长，见图1A。30日龄民猪睾丸：曲细精管直径为62～65μm，每个切面有22～25个支持细胞、4～6个生殖细胞。支持细胞的细胞核呈长椭圆形，有的细胞核位置移向管腔，见图1B。大部分生殖细胞附着在基膜上，或两个生殖细胞的细胞质紧密连接在一起。60日龄民猪睾丸：曲细精管直径为80～90μm，生殖细胞和支持细胞镶嵌排列，支持细胞的细胞质特别发达，细胞质相连，开始形成血睾屏障。有的部位出现两层细胞，每个切面有9～11个生殖细胞，见图1C。70日龄民猪睾丸：曲细精管直径为90～110μm，出现2～3层的细胞，管腔中央是支持细胞的细胞质，细胞质相连，支持细胞的细胞质边缘开始出现初级精母细胞，见图1D。90日龄民猪睾丸：曲细精管直径为130～150μm，基膜处2～3层细胞排列整齐的，支持细胞的细胞质发达，伸向管腔，细胞质内附着初级精母细胞，有的部位有精细胞，见图1E。110日龄民猪睾丸：曲细精管直径为180～210μm，管腔内有多层生殖细胞，并出现精细胞和变形的精子，见图1F、图1G。

2.2 生殖细胞迁移到基膜的电镜观察

生殖细胞迁移到基膜的过程中，首先是细胞质伸出伪足，进入支持细胞之间的空隙，逐渐附着到基膜上，转变为生殖干细胞，附着基膜时生殖细胞细胞质内的线粒体特别发达，见图2A、B，并进行有丝分裂。生殖细胞不断迁移，占据支持细胞的空间，将支持细胞的细胞核和细胞质挤压向管腔中心侧，伴随着生殖细胞的分裂，有的支持细胞的细胞核被挤压在基膜上，见图2C、图2D。

图2 30日龄民猪睾丸生殖细胞迁移到基膜的透射电镜观察

2.3 支持细胞发育的电镜观察

生殖细胞迁移到基膜后，不断分裂增殖，占据更多的空间，将支持细胞的细胞核和细胞质推向管腔中心方向或挤压在基膜，支持细胞之间形成连接，将不同类型的生殖细胞隔离开来，见图3A。同时，支持细胞的细胞质大面积扩张，细胞质内的线粒体特别发达，见图3B，随着生殖细胞的不断增殖与分裂，生殖细胞数量不断增多，分别形成精原细胞、精母细胞、精细胞，生殖细胞之间仅剩下支持细胞与支持细胞之间的膜相连，见图3C、图3D。在整个曲细精管内，随着生殖细胞的周期性变化，生殖细胞之间支持细胞的连接呈现不同的变化，形成明显的血睾屏障结构，见图3E、图3F。

图3 90，110日龄民猪睾丸支持细胞发育的透射电镜观察

2.4 免疫荧光染色观察

7日龄睾丸的免疫荧光染色结果见图4。图4显示：未成熟支持细胞的Connexin-43、Occludin、KRT-18染色结果呈阴性，ZO-1染色结果呈阳性；精原细胞的Connexin-43、Occludin染色结果呈阴性，KRT-18染色结果呈弱阳性，ZO-1染色结果呈阳性；间质细胞的Connexin-43、Occludin、KRT-18、ZO-1染色结果呈阳性。30日龄和7日龄睾丸的免疫荧光染色的鉴定结果一致，未列出。

图4 7日龄民猪睾丸曲细精管的免疫荧光染色结果

3 讨论

支持细胞血睾屏障的形成是维持精子发生的重要内环境［8］。家畜出生后，曲细精管内的支持细胞处于未成熟状态，均匀生长在基膜上，生殖细胞大部分处于曲细精管中心，属于性原细胞或生殖干细胞，之后逐渐向基膜迁移，并附着到基膜上，转变为精原干细胞。精原干细胞在分裂过程中，还会形成不同类型的A型精原干细胞，然后产生初级精母细胞［3-4］。在精原细胞进行有丝分裂的过程中，支持细胞不断成熟分化，形成发达的细胞质，细胞质之间形成血睾屏障的结构，保证初级精母细胞减数分裂和精子的形成［9-10］。本试验采用组织学切片进行观察，发现生殖干细胞向基膜迁移时利用细胞质向支持细胞的空隙内进行迁移，细胞质具有一定的极性并且此部位的线粒体增多，会进行一系列的生化反应，具体的机制还有待进一步研究。当生殖干细胞迁移结束后，线粒体均匀分布。支持细胞在发育过程中，主要是细胞质的扩张，两个支持细胞的细胞质之间进行多处连接，平面上呈类似网格状，立体上多个支持细胞相互连接，各级的生殖细胞能够穿过支持细胞之间的连接。支持细胞之间的连接构成多个微环境，保证生殖细胞的有丝分裂、减数分裂、精细胞变形等过程，而且能够吞噬凋亡的细胞、细胞质等。据此推断曲细精管内支持细胞和生殖细胞的模型结构为种子-土壤模型，即支持细胞的细胞质立体生长，相互连接，形成生殖细胞生长的支撑结构和环境。生殖细胞类似一粒种子，先钻入支持细胞空隙，然后向基膜运行；同时支持细胞立体生长，把生殖细胞包围在里面，随着生殖细胞的分裂，支持细胞的细胞质逐渐向上生长，形成更厚的支持细胞细胞质层。精细胞变形过程中，逐渐长出支持细胞细胞质层，在形成精子后脱离支持细胞细胞质，游离到管腔内，见图5。R.L.Brinster等［11］通过小鼠腹腔内注射白消安，消除内源性精子发生，制作曲细精管内只有支持细胞的受体鼠模型，组织学结果显示，曲细精管内支持细胞的细胞质相连，并有许多空泡样结构，这一结果也证实了支持细胞之间会形成多个连接和腔室，将不同阶段的生殖细胞隔离开来。

图5 曲细精管内的种子-土壤立体模型结构

民猪是中国东北地区的一个古老的地方猪种，具有产仔多、肉质好、抗寒、耐粗饲、繁殖力高、性成熟早的突出优点，是受保护的国家级地方品种。家畜的初情期和精子的产生是相伴发生的事件，初情期的出现又受到品种、营养、饲养条件等因素的影响［12］，饲料营养水平高、环境条件舒适，会促使家畜的初情期提前和曲细精管内精子提前发生。此外，相同条件下不同个体之间也会存在一定差异，导致不同个体的曲细精管内产生精子的时间不一样［13-14］。在本试验中即使同一个个体，不同的曲细精管内生殖细胞的增殖分化、产生精子的时间也不一致，这也可能是导致曲细精管内上皮波和源源不断产生精子的原因。

Connexin-43、Occludin、ZO-1是构成血睾屏障的重要蛋白，KRT-18是未成熟支持细胞的标志物［6-9］。本试验计划使用4种抗体染色，观察血睾屏障形成的形态变化，然而使用Connexin-43、Occludin、KRT-18、ZO-1对7，30日龄民猪睾丸的曲细精管进行免疫荧光染色，结果4种蛋白中没有支持细胞特异性的染色。Connexin-43、Occludin可能在未成熟支持细胞不表达，KRT-18在未成熟支持细胞没有染色，在生殖细胞却呈微弱染色；ZO-1在支持细胞和生殖细胞都着色。说明使用Connexin-43、Occludin、KRT-18、ZO-1染色无法专一性鉴定民猪支持细胞的发育和血睾屏障的形成，因此试验中没有继续对其他日龄的曲细精管进行染色。

4 结论

民猪支持细胞血睾屏障的形成在60～90日龄之间，90日龄之后血睾屏障已经具备了完整的功能，能够支持精子发生。