荧光聚多巴胺-金量子点应用于癌细胞的高效成像检测

周瑜 谭虹 邓谦亦 左芳

摘  要：为了准确识别癌细胞，制备了一种具有荧光性能的聚多巴胺-金量子点.该量子点纳米材料是基于前人方法，在室温下以多巴胺为唯一前体控制合成来制备小尺寸聚多巴胺，然后在高温、过氧化氢存在的条件下利用产生的羟基自由基去破坏聚多巴胺的π-π结构来生成具有荧光性能的聚多巴胺量子点，并在其表面通过还原氯金酸形成聚多巴胺-金量子点;利用荧光成像技术，通过观察聚多巴胺-金量子点的荧光淬灭情况来实现对癌细胞中谷胱甘肽（GSH）的检测.结果表明，该量子点纳米材料可以实现对癌细胞的特异性荧光成像检测，为开发高效的识别生物传感器和对癌细胞的精准识别提供了一种有效的策略.

关键词：癌细胞;聚多巴胺-金;谷胱甘肽;荧光成像;纳米材料

中图分类号：TB383;O657.3            DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2021.03.017

0    引言

癌症是人类最致命的疾病之一[1].中国每年新增癌症病例约439万例，死亡病例281万例[2].癌症治疗很复杂，生物医学领域的进步将癌症诊断研究带入了一个新的领域[3].荧光成像作为一种新的成像技术，因其较高的时空分辨率在生物医学研究中得到了广泛的应用[4-5].荧光成像时常用有机染料和无机纳米粒子（金属量子点）来识别癌细胞[6-7].然而，由于光稳定性差、水溶性低、毒性大、生物相容性差等原因，将各种有机染料和金属量子点作为荧光探针应用于荧光成像受到了限制.由于聚合物荧光纳米颗粒（PFNPs）具备优异的光学性能，毒性小，成本低，在药物传递、化学传感器、生物成像和生物分析等领域引起了人们极大的兴趣，被认为是生物医学应用的理想选择[8-9].尽管一些PFNPs具有良好的水溶性，但大多数PFNPs的水稳定性较差，需要对其进行复杂的功能修饰才能进一步应用于生物分析和生物成像[10].因此，开发水溶性理想、稳定性高、制备简单的荧光高分子材料具有重要意义.

与有机染料和金属量子点相比，10～20 nm的小尺寸荧光聚多巴胺量子点（PDs）具有独特的物理化学性质和良好的生物相容性，近年来得到了广泛的研究[11].它们不会对标记的生物分子的固有行为造成很大的损害，可以更好地穿透和分布在细胞间隙[12].然而，这些荧光纳米颗粒往往无法对癌细胞进行特异性荧光成像，因此，研制出具有特异性细胞成像功能且制备简单的荧光PDs具有重要意义.

由于癌细胞中谷胱甘肽（GSH）的浓度            （2～10 mmol/L）高于正常细胞，所以高浓度的GSH可以成为癌细胞的特异性标志物[13].依据文献[14]， GSH具有荧光淬灭作用，基于此，本文研究了一种在室温下一步氧化前体多巴胺（DA）合成荧光聚多巴胺-金量子点（PDs-g）的简便方法，并进一步验证了其在高灵敏度和选择性识别癌细胞中高表达的GSH方面的应用.同时，证明了此优化策略合成PDs-g是一种不需要复杂仪器的简单有效的方法，而且所制备的荧光PDs-g能较好地检测出癌细胞中的GSH，这为今后精准识别癌细胞提供了一种有效的策略.

1    实验方法

1.1   仪器和试剂

主要仪器：JEOL JEM 2010F 场发射透射电镜，日本JEOL公司; MALVERN ZETASIZER NANO ZS90动态光散射（DLS），英国MALVERN公司;紫外可见分光光度计，上海奥析科学仪器有限公司;SPECTRUM ONE 傅里叶变换红外光谱仪，美国PE仪器公司;FLUOROLOG-3型荧光分光光度计，法国HORIBA JOBINYVON公司;倒置荧光显微镜（FM）（蔡司德国）;原子力显微镜（AFM），日本日立公司.

主要试剂：盐酸多巴胺（DA）、氢氧化钠、四氯金酸水合物和氢硼酸钠均购于探索平台（上海）;谷胱甘肽购自南京化学试剂有限公司.

1.2   小尺寸聚多巴胺纳米粒子（PDA）的合成

PDA根据文献[15]制备，方法略有变化.首先，将盐酸多巴胺、NaOH溶液（20 mmol/L，50 mL）溶解于去离子水中，50 ℃加热搅拌5 h.最后，将产品离心洗涤3遍，保存在黑暗的地方.

1.3   荧光聚多巴胺量子点（PDs）的制备

依据文献[16]，将1.2所得产物添加到含有H2O2（20%，15 mL）和NaOH（2.5 mol/L，10 mL）的溶液（pH 10）中.将所得溶液（pH 10.4）加热回流     5 h，可观察到颜色由黑色变为黄色.反应混合物冷却至室温，然后用10%乙醇透析24 h（分子量为    1 kDa）.纯化产物的溶液（pH 7.4）保存在4 ℃条      件下.

1.4   荧光聚多巴胺-金量子点（PDs-g）的制备

将1.3所得产物加入含有氯金酸的溶液中，并缓慢逐滴加入NaBH4（1 mL）溶液.将所得溶液室温避光搅拌30 min，可观察到颜色由黄色变为深黄色.反应混合物用去离子水透析24 h（分子量为      1 kDa）.纯化产物的溶液（pH 7.4）避光保存在4 ℃条件下.

1.5   聚多巴胺-金量子点（PDs-g）的荧光检测

在该体系实验中，将PDs-g（1 mg/mL）纳米颗粒添加到 Tris?HCl 缓冲液中，该溶液在旋涡混合器上混合3 min，最终通过荧光分光光度计檢测其荧光光谱.

1.6   谷胱甘肽对聚多巴胺-金量子点（PDs-g）的荧光淬灭

首先将小鼠乳腺癌细胞（4T1）接种在直径为   20 mm的玻璃底培养皿上贴壁培养.24 h后，分别将PDs和PDs-g加至不同的培养皿中，根据实验要求继续孵育相应的时间，并设置空白对照组.然后用磷酸盐缓冲盐水冲洗培养皿3次，置于荧光显微镜下进行细胞荧光成像观察.

2   结果和讨论

2.1   聚多巴胺-金量子点（PDs-g）的表征与性能

聚多巴胺-金量子点的制备流程如图1所示.首先以DA为原料在氢氧化钠溶液中加热搅拌反应，制备小尺寸聚多巴胺纳米粒子（PDA），随后将PDA加入含有过氧化氢（H2O2）溶液中加热回流反应5 h，得到小尺寸具有荧光的聚多巴胺量子点纳米粒子（PDs），最后加入氯金酸（HAuCl4），通过逐滴加入硼氢化钠（NaBH4）得到荧光聚多巴胺-金量子点纳米粒子（PDs-g）.通过透射电子显微镜（TEM）表征PDA、PDs和PDs-g的形貌和大小，结果如  图2—图3所示.图2（a）为PDA的TEM图像和粒径（DLS）图，图中显示PDA的形貌分布较为均一，且粒径分布相对较窄，粒径约为40 nm.图2（b）则展示了PDs的TEM图像，可在图中看到一颗颗均匀分布的球状纳米颗粒，且平均直径约为（12[±]3）nm的PDs.通过原子力显微镜（AFM）和典型截面对PDs进行了分析，如图2（c）—图2（d）所示，结果表明，PDs呈球形且高度分布在5～6 nm.

图3（a）为PDs-g的TEM图像，由图3（a）可见，粒子是单分散的，但大小略有不同.高分辨率TEM（HRTEM）图像（图3（b））显示，PDs-g具有清晰的晶格结构，条纹间距为0.36 nm，与文献[17]一致.通过TEM中的EDS元素映射分析和高角环形暗场成像表征，结果显示，元素金（Au）均匀地分散在 PDs-g（图3（c）—图3（d））.为了进一步确认复合结构的形成，进行了能量色散X射线光谱图（EDS）表征，其结果如图3（e）所示.EDS结果表明，PDs-g中检出了Au元素.

与DA的吸收光谱（图4（a））相比，由于5，6-二羟基吲哚单元的形成，PDA的紫外光谱图显示从200～500 nm具有一个宽吸收峰.PDA在280 nm处的吸收强度相对较低，说明PDA中含有一定比例的多巴胺.PDs的光谱也显示了从200～500 nm具有一个宽吸收峰，表明PDs应该具有与PDA相同的结构.如图4（b）所示，利用傅里叶红外光谱（FTIR）对其进行了表征，红外吸收峰宽带（3 343～3 226 cm?1）可能属于N—H和—OH伸缩振动，2 960 cm?1的结果是C—H伸缩振动模式.1 608 cm?1处的吸收振动峰归因于—NH2.这些结果表明，PDA和PDs的表面由于自然氧化而含有大量的含氧和氮基团. 基于此，本文研究了DA、PDA和PDs的荧光性质.在360 nm处激发时，只有PDs在450 nm处产生了荧光发射峰（图4（c））.在相同的激发波长下，聚多巴胺纳米粒和DA在450 nm处没有荧光发射峰（图4（c））.用不同的激发波长去激发PDs，当激发波长从300 nm增加到500 nm时，最大发射从 447 nm移动到556 nm（图4（d）），结果表明，PDs的最大发射强度与激发波长密切相关，且在激发波长为      360 nm时，具有最高强度的发射波长.

为验证PDs-g在较为严苛的环境中是否仍具有荧光检测效果，研究了PDs-g在不同盐浓度中的荧光稳定性情况，结果如图5（a）所示.由图5（a）可知，即使在氯化钠盐浓度达到500 mmol/L时，PDs-g的荧光强度几乎没有减弱.同时，研究了不同pH值条件下对PDs-g的荧光性能的影响情况，结果如图5（b）所示.从结果可知，PDs-g的荧光强度无论是在酸性条件下，还是在碱性条件下，其荧光强度均未发生改变.以上结果证明了该PDs-g无论是在高浓度盐条件下，还是酸碱条件下，都具有较好的荧光稳定性，这为日后的应用奠定了一定的基础.

2.2   荧光聚多巴胺-金量子点对癌细胞荧光成像

利用荧光显微镜研究了PDs-g对癌细胞的荧光成像检测能力.将4T1作为模型细胞，分为3组（空白对照组、PDs组和PDs-g组），荧光图像如图6所示.由图6可见，空白对照组的4T1没有检测到任何荧光，而PDs组的4T1则发出明显的蓝色荧光，表明PDs能对癌细胞进行细胞层面的荧光成像.值得注意的是，PDs-g组与4T1孵育12 h后，其荧光几乎消失不见.这归因于癌细胞内高浓度过表达的谷胱甘肽（GSH）通过Au—S键键合在了PDs-g表面，使其荧光发生了淬灭[18].

对PDs-g与4T1进行了不同孵育时间的实验，如图7所示.从图7可以看到，当PDs-g与细胞孵育2 h时，此时的PDs-g应该是刚刚被内吞到4T1中，而癌細胞里的GSH还未键合到PDs-g表面上，因此，可以看到其发出的强烈蓝色荧光.而当PDs-g与癌细胞孵育8 h后，其蓝色荧光几乎消失了.这表明癌细胞中高浓度的GSH已经键合到其表面了，使PDs-g的荧光发生了淬灭.以上结果表明，通过监测PDs-g在癌细胞中的荧光变化情况可以实现对癌细胞的特异性荧光成像检测.

3    结论

本文基于前人的方法合成出小尺寸的聚多巴胺纳米粒子之后，在高温和过氧化氢存在的条件下，利用产生的羟基自由基去破坏聚多巴胺的π-π结构来生成具有荧光性能的聚多巴胺量子点，并通过在其表面还原氯金酸制备出了具有荧光性能的聚多巴胺-金量子点.同时，利用透射电镜、粒径、荧光光谱等表征手段对制备的聚多巴胺-金量子点进行了一系列表征，并利用荧光成像方法，将聚多巴胺-金量子点与癌细胞共孵育后，观察到癌细胞能有效地淬灭聚多巴胺-金量子点的荧光，该结果表明聚多巴胺-金量子点能够精准地识别出癌细胞.

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High efficiency imaging detection of cancer cells by fluorescent

polydopamine-gold dots

ZHOU Yua， TAN Honga， DENG Qianyia， ZUO Fangb

（a. Institute of Qinghai-Tibet Plateau; b. School of Chemistry & Environment， Southwest Minzu University， Chengdu 610041， China ）

Abstract： A kind of fluorescent polydopamine-glod dots were prepared to identify cancer cells accurately. Based on the previous method， small size polydopamine was synthesized at room temperature with    dopamine as the only precursor， then， the hydroxyl radical was used to destroy the π-π structure of  polydopamine at high temperature in the presence of hydrogen peroxide， which can be used to generate polydopamine dots with fluorescence properties. Finally， chloroauric acid was reduced on its surface to form polydopamine-glod dots. Glutathione （GSH） in cancer cells was detected by fluorescence imaging by observing the fluorescence quenching of polydopamine-gold quantum dots. The results show that the quantum dot nanomaterials can realize the specific fluorescence imaging detection of cancer cells， which provides an effective strategy for developing efficient recognition biosensors for cancer cells and identifying cancer cells accurately.

Key words： cancer cells; polydopamine-glod; glutathione; fluorescence imaging; nano materials

（責任编辑：黎   娅）