不同尿素含量培养条件下复合菌系GF-20菌种组成及功能差异

青格尔，于晓芳，高聚林，胡万吉，王志刚，孙继颖，胡树平,

(1.内蒙古农业大学 农学院，呼和浩特 010019；2.内蒙古自治区作物栽培与遗传改良重点实验室，呼和浩特 010019；3.内蒙古农业大学 职业技术学院,内蒙古包头 014100)

提升耕地质量是中国农业可持续发展的重要保障。秸秆还田是培肥地力的有效措施之一[1-2]，玉米秸秆原位生物腐解是促进北方低温地区还田玉米秸秆快速分解并生成高质量腐解产物的有效途径。而玉米秸秆中的木质纤维素成分难以快速分解是限制秸秆生物转化和资源化利用的关键技术瓶颈[3]，针对这一问题，国内外学者不断探索和优化新的秸秆纤维素转化和利用技术，其中秸秆生物降解技术是有效促进作物秸秆分解进程的新途径，国内外很多学者从自然界中筛选获得了大量的纤维素分解菌[4-5]，及含有多种功能微生物具有较高的代谢和增殖能力并且能分泌多种酶的复合菌系[6-8]。但关于木质纤维素降解微生物的研究，主要集中在较高温度下秸秆降解菌系的筛选和应用，而对于低温高效降解菌的研究相对薄弱，筛选出的高效降解菌系(种)较少。内蒙古农业大学玉米科技创新团队(以下称本团队)经多年低温降解菌系筛选应用研究形成了菌系的高效筛选及低温驯化技术体系，利用该技术筛选出了低温高效降解菌系GF-20[9]，表现出良好的降解效率。前人研究表明，不同培养条件显著影响复合菌秸秆降解效率及菌种组成多样性[10-12]。Maruthamuthu等[13]研究发现复合菌在不同碳源处理条件下其菌种组成发生显著差异，进而影响功能代谢途径；厉文成等[14]对木薯渣高效降解复合菌系RXS进行氮源优化，获得了廉价氮源培养基。李文哲等[15]研究不同氮源对复合菌系LZF-12发酵特性，发现浓度0.5%(鸡粪+红糖)为氮源的条件下可达到良好的分解率。

在农业生产实践中，秸秆原位还田一般配施氮肥(北方玉米种植区一般施用尿素)，一是有利于还田秸秆的快速腐解，二是防止土壤微生物繁殖与作物生长竞争氮素[16]。因此秸秆原位生物腐解微生物能否适应其尿素氮源无疑关系到菌系的继续开发和利用。而本团队经长期碳源限制性继代培养与低温驯化培养获得具有良好的秸秆降解特性的复合菌系GF-20是以硫酸铵为氮源[9]。鉴于此，为使复合菌系GF-20的高效降解能力在生产中能更好的发挥，通过限制性继代培养研究其尿素氮源适应性，探明不同尿素氮源含量驯化过程中复合菌系菌种组成变化及KEGG(代谢通路)代谢功能的差异，为复合菌系的开发利用提供理论依据和技术支持，也对其他高效降解菌系的筛选和利用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2018年6月—2019年6月在内蒙古农业大学玉米中心进行。供试复合菌系GF-20为内蒙古农业大学玉米中心微生物实验室筛选驯化的纤维素低温高效降解复合菌系(编号为N1)[9]，有效活菌数为≥108CFU/mL，其优势菌属为纤维弧菌属(Cellvibrio)、固氮螺菌属(Azospirillum)、黄杆菌属(Flavobacterium)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)等。玉米秸秆取自内蒙古农业大学蒙西综合试验站(内蒙古包头市土默特右旗沟门镇)试验田收获的玉米秸秆(C/N 为48.98，纤维素、半纤维素和木质素含量分别为50.36%、33.59%和9.65%，全氮 6.67 g/kg，全磷 2.78 g/kg，全钾 11.48 g/kg)，洗净烘干后剪成1～2 cm短节。供试滤纸为Whatman No.1。

1.2 培养条件

基础培养基：(NH4)2SO42.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、CaCO32.0 g、NaCl 0.2 g、蒸馏水 1 L。10 mL 培养基分装于 25 mL 试管中，贴管内壁放入 1 cm×10 cm 滤纸条[9]。玉米秸秆培养基：40 mL 基础培养基和 1 g 玉米秸秆碳源装入100 mL三角瓶中,置于 10 ℃恒温条件下静置培养。

1.3 试验设计

试验以基础培养基为继代培养基，复合菌系GF-20以5%(V/V)的接种量接入基础培养基中，在10 ℃恒温条件下培养3～7 d，进行尿素驯化处理。在培养基中逐渐添加尿素氮源、同比例减少硫酸铵含量进行继代培养，当培养基中滤纸条黄化断裂时间一致时吸取滤纸降解处的培养液，转接到新的培养基中，如此逐渐增加基础培养基中尿素的含量，直至将氮源硫酸铵完全替换为尿素。培养 10 代直到滤纸断裂时间与原氮源培养基断裂时间一致时停止驯化，分别获得不同氮源复合菌系，即硫酸铵+尿素分别是 0.2%+0(原始菌系GF-20，N1)、0.16%+0.04%(N2)、 0.12%+0.08%(N3)、0.08%+0.12%(N4)、 0.04%+0.16%(N5)、0+0.2%(N6)，共计6个处理，每处理均 3 次重复，驯化复合菌系氮源适应性。

1.4 测定项目及与方法

1.4.1 MiSeq高通量测序 不同氮源处理菌系培养10 d后，在无菌条件下吸取培养液5 mL，采用细菌基因组DNA提取试剂盒(中国，天根生化科技有限公司)提取各复合菌系的基因组DNA，利用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。将基因组DNA送至北京奥维森基因科技有限公司(Allwegene Tech.,Co.,Ltd.,Beijing)完成MiSeq高通量测序，扩增区域为16Sr RNA，引物为338F和806R，对获得的数据通过序列拼接、过滤和去嵌合体得到优化序列，进行OTU聚类及注释(登录号SRP17734134-18834151)。

1.4.2 玉米秸秆降解效率 不同氮源处理菌系以 5%的接种量接入玉米秸秆培养基中，在 10 ℃恒温条件下培养30 d后，采用失重法测定玉米秸秆降解率，采用DNS法测定滤纸酶活性和内切酶活性，3次重复。

1.5 数据统计分析

利用QIIME(v1.8.0)软件以97%相似度水平将序列进行聚类物种分类的OTU(Operational Taxonomic Units)，获得物种分类水平的比例信息及不同分类水平的群落结构；通过Uclust(Version 1.8)、Usearch(Version 8.1.1861)等数据库进行物种比对，得到各水平的分类信息，进行样本组成及样本间群落结构差异相关分析、ANOSIM相似性分析、共线性网络图分析和PCA分析；采用R(v 3.1.1)绘制各样品在各个分类水平的比较图，基于聚类结果，进行Alpha多样性覆盖深度、物种丰富度chao1指数、物种数、谱系多样性指数、香浓指数分析。基于测序得到的序列，与KEGG(代谢通路)数据库进行 比对。

2 结果与分析

2.1 不同处理复合菌系alpha多样性指数分析

复合菌系多样性指数如表1 所示，覆盖深度指数均在0.99以上，说明本次高通量测序结果基本能代表样品的真实情况。物种丰富度Chao1指数表现为N1～N5处理间无显著差异，而N6处理显著低于其他处理；N2处理物种数最高为59.93，显著高于N1、N5和N6处理；谱系多样性指数则N2显著高于其他处理，为6.14，N6显著低于其他处理，为4.18；香浓指数表现为N2显著高于其他处理，为4.35，N1显著低于其他处理。综合各处理alpha多样性指数分析发现，N2处理alpha多样性指数较其他处理高，说明其物种组成更加丰富和多样。

表1 复合菌系alpha多样性指数Table 1 Diversity indexof bacteria microbiome alpha

2.2 不同处理复合菌系细菌物种丰度及其差异分析

对各处理复合菌测序结果进行物种比对，得到各水平的分类信息。门分类水平变形菌门(Proteobacteria)在所有处理中丰富度最高，其次为拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)。为探明不同氮源处理对复合菌菌种组成丰度的影响程度，采用组间显著性差异检验分析物种差异，结果如表2所示，不同氮源处理复合菌系物种组成丰度具有显著差异，变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、蓝细菌门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和绿菌门(Chlorobi)丰度均存在极显著差异。变形菌门相对含量在N3和N4间差异不显著，丰度分别为85.52%、 87.34%和83.88%，N2和N5条件下丰度显著低于其他处理，丰度分别为52.33%和66.14%；N2条件下拟杆菌门的相对丰度显著高于其他处理，丰度为37.01%，N3～N5间丰度差异不显著；N5条件下放线菌门丰度显著高于其他处理，为 26.11%；在N2条件下蓝细菌门丰度显著高于其他处理，为9.08%。

表2 不同氮源处理条件下复合菌系门水平细菌群落丰度Table 2 Bacteria community abundance of phylumlevel under different nitrogen conditions %

属分类水平(表3)，各处理复合菌主要由纤维弧菌(Cellvibrio)、固氮螺菌(Azospirillum)、黄杆菌(Flavobacterium)、土地杆菌属(Pedobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、纤维单胞菌(Cellulomonas)等组成，但其丰度具有显著差异。选择丰度前20的属进行差异分析发现，不同氮处理条件下除德沃斯氏菌(Devosia)和Pleomorphomonas外，其余属丰度均存在显著差异，纤维弧菌、固氮螺菌和Fluviicola相对含量在N1处理条件下显著高于其他处理，丰度分别为 74.54%、7.40%和3.78%，而在N5条件下丰度显著低于其他处理；假单胞菌在混合氮源N3和N4条件下丰度显著高于其他处理，为55.72%和 56.72%；纤维单胞菌、Niveispirillum、食酸菌(Acidovorax)和氢噬菌(Hydrogenophaga)在N5条件下丰度分别为25.98%、28.11%、 10.97%和 6.36%显著高于其他处理；Taibaiella、产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium)和Dysgonomonas的丰度在N2条件下显著高于其他处理，丰度分别为5.42%，3.71%和2.35%；短波单胞菌(Brevundimonas)、黄杆菌(Flavobacterium)和无色杆菌(Achromobacter)在N6条件下丰度显著高于其他处理，丰度分别为 18.52%、 12.80%和12.56%。由此可知，不同氮源处理条件下，各复合菌系间物种存在显著差异，说明不同的外界营养条件会影响复合菌系的物种组成丰度。

表3 不同氮源处理条件下复合菌系属水平细菌群落丰度Table 3 Bacteria community abundance of guans level under different nitrogen conditions %

2.3 不同处理复合菌系物种ANOSIM相似性分析

利用共线性网络图分析法直观显示不同氮处理复合菌系菌种组成相似性及重叠情况。结果如图1所示，所有处理中重合的菌属数目是32个，主要分布在纤维弧菌(Cellvibrio)、假单胞菌(Pseudomonas)、纤维单胞菌(Cellulomonas)、黄杆菌(Flavobacterium)、无色杆菌(Achromobacter)、土地杆菌(Pedobacter)、短波单胞菌(Brevundimonas)、德沃斯氏菌(Devosia)、食酸菌(Acidovorax)、固氮螺菌(Azospirillum)等中，差异菌属丰度均低于0.01%。为探明不同氮源处理复合菌菌种组成的相似性，采用4种不同的距离计算方法计算属水平的群落相似性，结果如表4所示，不同计算方法均显示群落结构存在显著差异(P< 0.05)，并具有较高的解释度，再次验证在不同尿素氮源含量条件下，复合菌系菌种组成丰度存在差异。

表4 不同氮处理复合菌系ANOSIM相似性分析Table 4 ANOSIM analysis of microbial consortia under different nitrogen conditions

2.4 不同处理复合菌系物种组成及功能PCA分析

基于不同处理物种属水平组成及丰度和KEGG功能分布，计算不同处理间的距离结果如图2-A、图2-B所示，第一、二主成分的贡献率分别是59.4%、28.7%和74.2%、19.1%，其中N2和N6处理距离较近，N3和N4距离较近，说明其物种组成及功能较为相似；而N1和N5分布均较分散，说明其物种组成丰度和功能差异较大。物种组成多样性决定功能特性，物种的组成及丰度的差异性导致功能多样性。

2.5 不同处理复合菌系KEGG功能差异分析

各处理复合菌系选取KEGG 第二水平功能注释结果发现，碳水化合物代谢和氨基酸代谢丰度较大，均在12%和9%以上(图3)。为了探明纯硫酸铵处理(N1)和纯尿素处理(N6)对复合菌功能多样性的影响，选取KEGG第三水平碳水化合物代谢进行差异分析(图4)，结果表明戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化、磷酸戊糖途径、半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、淀粉和蔗糖代谢和抗坏血酸盐和藻酸盐代谢等代谢通路丰度呈N1显著高于N6，其余代谢呈N6显著高于N1，说明不同氮处理可显著影响复合菌系的功能代谢注释丰度。

2.6 不同处理复合菌系秸秆降解效率

由表5可知，玉米秸秆降解率在N2处理条件下显著高于其他处理，而N1和N6处理间无显著差异；滤纸酶和内切酶表现为N1、N3、N4、N5和N6间无显著差异。说明复合菌系虽然在尿素驯化过程中菌种组成丰度和KEGG代谢丰度存在差异，但在纯硫酸铵和尿素条件下秸秆降解性能无显著差异，复合菌通过协同代谢完成木质纤维素的降解，对尿素氮源具有良好的适应性和稳定性。

表5 不同氮源处理条件下复合菌系秸秆降解率及酶活性Table 5 Straw degradation and cellulase under different nitrogen conditions

3 讨 论

目前，针对秸秆降解菌筛选驯化多集中在中高温功能菌系/菌株，而针对北方寒旱区玉米秸秆原位还田促腐功能菌系研究较少，且生产实践中秸秆还田往往配施尿素调节碳氮比，因此有必要探明菌系对氮源的适应性及其菌种组成结构，以提高降解菌系的稳定性和适应性。因此，试验以本团队已筛选出的低温高效降解复合菌系 GF-20为对象，开展尿素氮源驯化，探明不同尿素氮源含量条件下复合菌系菌种组成和功能丰度及其差异性。

3.1 不同氮源处理条件下复合菌系细菌群落组成及功能分析

根据共线性网络方法分析统计不同氮源处理条件下复合菌中所共有属水平数目是32，其中各处理平均丰度高于2%的菌属有纤维弧菌、假单胞菌、纤维单胞菌、黄杆菌、无色杆菌、土地杆菌、短波单胞菌、德沃斯氏菌、食酸菌、固氮螺菌等。纤维弧菌属菌是典型的纤维素降解菌，可分泌多种纤维素和半纤维素降解酶系，降解羧甲基纤维素、纤维素、半纤维素、几丁质等[17-18]，其中Cellvibriomixtus属于产纤维素酶类的兼性厌氧微生物，分泌的纤维素酶属于典型的低温纤维素酶[19]；假单胞菌属的许多种因其有氧降解能力，分泌胞外酶(蛋白酶和脲酶水平很高)，参与复杂碳水化合物的代谢[20]；食酸菌属也常存在于秸秆降解复合菌中，具有秸秆降解功能[21]；许多纤维单胞菌属的细菌应用于秸秆生物降解和生物修复领域，分泌的纤维素酶活性高[21-23]；土地杆菌和黄杆菌大多源自于土壤，可利用秸秆降解中间代谢产物促进秸秆分解，分泌过氧化氢酶、氧化酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶等，利用丙酸、乳酸等秸秆降解中间产物，消除底物反馈抑制作用，可利用碳水化合物、醇类和糖苷类等[24-27]；司美茹等[28]和唐玉斌等[29]从被石油污染的土壤和焦化污泥中分离出无色杆菌属的菌，几乎能彻底降解C12-C23 和C27-C43的烷烃和多环芳香烃，能氧化木糖，具有过氧化氢酶和氧化酶活性；德沃斯氏菌属能分泌过氧化氢酶，利用木糖、戊醛糖、纤维素等[30-31]；短波单胞菌属可分泌葡萄糖苷酶等纤维素酶，参与秸秆物质的降解[32]；固氮螺菌属一般与Niveispirillum菌属协同发挥降解作用[33]。各处理复合菌系KEGG预测功能主要为碳水化合物代谢和氨基酸代谢。综上说明，在不同尿素氮源含量条件下，复合菌系仍保持了较多的功能微生物，复合菌GF-20具有良好的适应性，促进秸秆的分解。

3.2 不同氮源处理条件下复合菌系细菌组成及功能差异分析

根据ANOSIM相似性分析以及差异性分析表明在不同氮源条件下，复合菌的菌种组成及其丰度均存在一定的差异性。纤维弧菌在N1处理中丰度为74.54%，在N6中为31.13%，而在N5中丰度仅仅为0.81%，说明在单种氮源条件下尤其是在硫酸铵氮源条件下丰度较高；假单胞菌属更多的参与信号转导等，促进木质纤维素的降解，其在混合氮源N3、N4条件下丰度显著高于其他处理，说明其更加适应于混合氮源环境；纤维单胞菌是典型的纤维素分解菌，常用于菌剂的研制，其丰度在N5条件下较高，说明尿素含量偏高的混合氮源有利于其生长；黄杆菌、无色杆菌和短波单胞菌在N1中丰度仅为1.40%、0.08%和 0.03%，在N6中为12.80%，12.56%和 18.52%，说明尿素为唯一氮源促进其生长。食酸菌、固氮螺菌等丰度高于0.1%的属在N1和N2中存在，但N6中未检测到，可能是由于以上菌属不能以尿素为唯一氮源，在继代过程中逐渐被淘汰或含量显著降低。不同氮源处理复合菌系间，N2处理alpha多样性指数显著高于其他处理，菌种组成多样较高。结构决定功能，不同氮源处理导致复合菌系菌种组成丰度存在差异，导致注释功能丰度PCA分布存在差异，N2、N6和N3、N4距离较近。不同氮源处理条件下复合菌系功能代谢较相似，其中碳水化合物代谢注释丰度较大(KEGG中12%以上)，说明各处理复合菌系中含有大量可降解秸秆类木质纤维素生物质的微生物，这与文献报道的秸秆降解微生物代谢通路类似[6,34]，且在N1和N6处理条件下KEGG碳水化合物第3水平代谢通路注释丰度存在显著差异，不同培养条件影响复合菌系菌种组成，进而影响代谢。李锋[35]和Alessi等[36]研究表明在不同培养条件下，碳水化合物代谢表达具有差异，复合菌通过协同多种代谢途径完成木质纤维素的 降解。

4 结 论

在不同尿素氮源含量条件下，复合菌系菌种组成相似，保持了较多的关键功能菌，但菌种组成丰度显著，其中N2处理(硫酸铵和尿素含量为 0.16+0.04%)复合菌的alpha多样指数较高。不同处理间菌种丰度差异主要体现在变形菌门和拟杆菌门的纤维弧菌、假单胞菌、纤维单胞菌、黄杆菌等菌属中，物种组成差异主要体现在Solitalea、指孢囊菌属(Dactylosporangium)等丰度较低的物种中。不同处理复合菌中碳水化合物代谢和氨基酸代谢注释丰度较高，其中N1和N6处理间碳水化合物代谢通路丰度存在显著差异，但玉米秸秆降解效率无显著差异。