干酪乳杆菌Zhang在逆境条件下基因表达的差异分析

张 猛，贾 星，张和平，马学波，包秋华

干酪乳杆菌Zhang （Lactobacillus casei Zhang，Lb.casei Zhang）是内蒙古农业大学从内蒙古地区传统发酵酸马奶中分离筛选的一株具有益生特性的乳酸菌[1]。经研究表明该菌株具有良好的耐酸性、人工肠胃液耐受性及胆盐耐受性，是我国第一个完成的乳酸菌基因全序列测定的菌株[1-3]。干酪乳杆菌Zhang 是我国目前研究较全面的一株益生菌，是能通过改善肠道微生物平衡而对宿主产生有益影响的乳酸菌[1，4]。

乳酸菌对营养、环境条件要求高，对外界的抵抗力差，难以制备和长期保存。乳酸菌在生产和应用过程中，不可避免的要经历低温、低pH 值、寡营养、外界环境变化、光照及辐射强度等不利条件，一旦外界营养条件或环境压力发生改变，菌株的形态特征、生理状况和功能特性等都会发生改变，这不仅导致菌株活力下降，也影响了菌株在工业化生产中的发酵性能、代谢产物的合成及其益生特性，有些乳酸菌能够进入活的非可培养（Viable but non-culturable，VBNC）态[5-9]。目前乳酸菌面临的多种胁迫中，酸胁迫是最常见的一种环境胁迫[7]。环境中pH 值的下降会抑制乳酸菌自身的生长繁殖。除酸胁迫外，低温胁迫也会对细胞造成一系列伤害，包括细胞脱水、细胞膜破裂以及内容物泄露等，导致细胞不可逆的损伤或者死亡[4，6]。

关于干酪乳杆菌Zhang 和乳酸菌的抗逆基因和蛋白表达的报道有很多。乌日娜等[10]通过双向凝胶电泳技术研究了其在不同生长阶段下差异表达蛋白质，结果表明酸胁迫可诱导干酪乳杆菌Zhang 产生复杂的反应，差异蛋白主要归属于应激蛋白及不同代谢途径相关蛋白，参与调节糖代谢途径、氨基酸合成、脂肪酸合成途径等；通过调节ABC 转运系统的活性以及调控双组分系统及离子转运系统的活性等来应对环境的改变。其它大量研究也表明，乳酸菌遭遇逆境环境，会激活多种应激反应去应对不利于生存的条件，如乳酸菌会通过改变代谢途径，增加ATP 的产生[10-11]、自我调节胞内pH 值[12-13]、在细胞膜水平上的胁迫响应[14-15]以及大分子的保护与修复等应激反应来抵御环境胁迫从而提高存活率[16-17]。蛋白的变化首先表现在转录水平上，干酪乳杆菌Zhang 全基因组测序的完成为研究该菌的基因转录表达分析奠定了基础[2]。本试验将在前人基础上，选择干酪乳杆菌Zhang 能够进入VBNC 态的一个逆境条件，研究干酪乳杆菌Zhang 在逆境胁迫初期的基因表达差异变化。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

干酪乳杆菌Zhang，内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种资源库保存。

1.2 材料与试剂

MRS 液体培养基，英国Oxoid 公司；Eastep Super 总RNA 提取试剂盒LS1040，美国Promega公司；GoScript Reverse Transcription Mix 试剂盒，美国Promega 公司；GoTap qPCR Master Mix试剂盒，美国Promega 公司。

1.3 仪器与设备

PCR 热循环仪、ABI StepOnePlus 实时荧光定量PCR 仪，美国Applied Biosystems 公司；ND-1000 型微量紫外分光光度计，美国赛默飞科技公司。

1.4 目的基因及管家基因

根据干酪乳杆菌Zhang DNA 序列 （NCBI 官网GeneBank accession number：CP001084）中相应基因的序列，使用primer 5 软件设计12 对引物，由上海美吉生物科技有限公司合成。具体见表1。

表1 实时荧光定量PCR 的内参基因及目的基因引物Table 1 Reference genes and target genes of real-time quantitative PCR

1.5 方法

1.5.1 干酪乳杆菌Zhang 的活化和环境胁迫 将菌种资源库的干酪乳杆菌Zhang 接种于液体MRS培养基，37 ℃培养18～24 h，按2%的接种量活化3代，得到3 代菌株，测得此时的培养基pH 值趋于稳定，维持于3.8±0.02。将菌液放置于4 ℃条件下进行低温、低pH 值逆境胁迫。

1.5.2 RNA 提取 逆境胁迫的菌株分别于0，6，24 h 及3 d 取样，首先将供试样品摇匀后吸取1 mL 液体（约109细胞），离心收集菌体后按Eastep Super RNA 提取试剂盒说明书进行总RNA 的提取，用微量分光光度计对RNA 的质量进行检测。

1.5.3 反转录反应 以纯化的RNA 为模板，使用GoScript Reverse Transcription Mix 试剂盒进行反转录，反应体系见表2。将混匀的反应体系置于PCR 仪中，以25 ℃引物退火5 min；42 ℃延伸60 min；70 ℃灭活15 min 的条件进行。得到cDNA 样本后置于-20 ℃保存。

表2 反转录体系Table 2 Reverse transcription system

1.5.4 荧光定量PCR 以各时间点cDNA 为模板，采用Promega 公司的GoTap qPCR Master Mix试剂盒，荧光定量PCR 反应体系如表3所示。将混匀的反应体系在荧光定量PCR 仪中进行PCR扩增。每个基因做3 个重复，由Gene line K 自带软件采用“最大二阶导数法”得到各基因各时间点表达水平的Ct值。Ct值即反应管内的荧光信号达到设定的阈值所需的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数呈线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小[18]。

表3 荧光定量PCR 扩增体系Table 3 Real-time qPCR amplification system

荧光定量PCR 扩增条件：预变性95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，循环40 次。熔解曲线测定程序：95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；95 ℃，15 s。

荧光定量PCR 数据处理分析采用相对定量方法，目的基因的相对表达量由下列公式得出：

△Ct（测试基因）=△Ct（目的基因，测试基因）-△Ct（内参基因，测试基因）

△Ct（校准基因）=△Ct（目的基因，校准基因）-△Ct（内参基因，校准基因）

△△Ct=△Ct（测试基因）-△Ct（校准基因）

平均相对含量%=2-平均△△Ct

试中：△Ct（目的基因，测试基因）——待测组目的基因Ct值；△Ct（内参基因，测试基因）——待测组管家基因Ct值；△Ct（目的基因，校准基因）——校准组目的基因Ct值；△Ct（内参基因，校准基因）——校准组管家基因Ct值。

2 结果与分析

2.1 荧光定量PCR 产物的特异性

对内参基因及目的基因进行荧光定量PCR扩增，随后对各个基因进行熔解曲线分析，部分熔解曲线结果如图1。通常情况下，溶解曲线是用荧光信号强度变化负的一次导数和温度作图，如果得到单峰的熔解曲线，证明反应特异性良好，无非特异扩增和引物二聚体等干扰结果因素[19]。从图1可看出，本试验得到了内参基因及目的基因的单峰熔解曲线（注：Tm，DNA 双链碱基对分离50%的温度），且每个基因温度均一、峰型较锐利，无非特异性扩增和引物二聚体所致的杂峰，表明荧光定量PCR 扩增产物的特异性较好，也证明所设计的引物具有较好的特异性。

图1 熔解曲线Fig.1 Melting curve

2.2 低温、低pH 值逆境胁迫下目的基因的表达变化

通过RT-qPCR 方法分析菌株于低温、低pH值胁迫下的12 个基因表达差异。结果表明干酪乳杆菌Zhang 为了抵御外界低温、低pH 值的不良环境，激活了细胞中一系列适应性调节，如糖代谢途径，通过调节丙酮酸代谢产物去向，使之倾向于参与脂肪酸合成，同时通过激活分子伴侣蛋白合成来促进其它蛋白的正确折叠，从而帮助菌体抵御低温、低pH 值的胁迫。

2.2.1 糖代谢相关基因的表达差异结果与分析与糖代谢相关的基因共4 个，分别为LCAZH_0682、LCAZH_0721、LCAZH_1056、LCAZH_1073，结果见图2。

从图2可以看出LCAZH_0682 （苹果酸乳酸酶基因） 胁迫24 h 的表达量增长为对照的1.766倍，胁迫3 d 的表达量为对照的1.771 倍，均与对照有显著性差异（P<0.05）。LCAZH_0682 参与苹果酸-乳酸发酵途径[10，20]，此结果表明干酪乳杆菌Zhang 在低温、低pH 值胁迫下苹果酸乳酸酶活性增加，苹果酸-乳酸代谢水平提高。这与王记成[20]发现干酪乳杆菌Zhang 在发酵过程中会提高乳酸脱氢酶、苹果酸/乳酸逆转运体活性的结果相一致。

图2 低温、低pH 值胁迫下糖代谢相关基因表达差异图Fig.2 Gene expression differences in carbohydrate metabolism at low temperature and low pH condition

LCAZH_0721 （6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因）在胁迫6 h 后表达量增长为对照的1.998 倍，与对照差异极显著（P<0.01）。胁迫24 h 后增长为1.177倍，3 d 后增长为1.306 倍，均与对照有显著差异（P<0.05）。LCAZH_0721 参与磷酸戊糖途径。结果表明，低温、低pH 值胁迫下的干酪乳杆菌Zhang磷酸戊糖途径被激活。表明逆境胁迫下的干酪乳杆菌Zhang 通过调整代谢途径，进行酸适应。

LCAZH_1056 基因编码PTS system cellobiose-specific transporter subunit IIA，磷酸转移酶系统丝氨酸特异性转运蛋白，参与map02060（Phosphotransferase system，PTS）；map00500（Starch and sucrose metabolism）2 个代谢途径，在低温、低pH 值胁迫下其表达呈下降趋势，胁迫6 h 后其表达量降为对照的0.767 倍，胁迫24 h 后降为0.621倍，均与对照有显著差异（P<0.05）。胁迫3 d 后其表达量为0.567 倍，与对照差异极显著（P<0.01）。吴重德[21]研究发现干酪乳杆菌在正常条件下磷酸转移酶系统丝氨酸特异性转运蛋白活力较高，而pH 5.0 下胁迫1 h 后，磷酸转移酶系统丝氨酸特异性转运蛋白活力显著下降。这就表明干酪乳杆菌在低温、低pH 值胁迫下会降低PTS 的表达。

LCAZH_1073 基因编码UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶（EC2.7.7.9），催化α-D-葡萄糖-1-磷酸和UDP-葡萄糖之间互相转化的酶。LCAZH_1073 基因在低温、低pH 值胁迫下表达上调，胁迫6 h 后表达量增长为对照的1.102 倍，24 h 后增长为1.267 倍，3 d 后增长为1.600 倍，均与对照有显著差异（P<0.05）。表明低温、低pH 值胁迫的菌株会减少自身糖原的合成。

以上试验表明，低温、低pH 值逆境胁迫下干酪乳杆菌Zhang 会调节糖代谢途径，提高苹果酸-乳酸发酵、磷酸戊糖途径、磷酸转移酶系统丝氨酸特异性转运蛋白的表达量以及减少自身糖原的合成。干酪乳杆菌Zhang 是一种兼性异型发酵菌，主要通过糖酵解途径产生能量。由于环境中pH 值较低，H+堆积，乳酸含量高，通过LCAZH_0682（苹果酸乳酸酶基因）的高度表达，促使乳酸外排来有效缓解H+压力[20]。因为在苹果酸乳酸发酵中，苹果酸乳酸酶经过去羧基将苹果酸转化为L-乳酸和CO2，苹果酸/乳酸逆转运体成了乳酸的载体，这一过程促使细胞质的碱性化并允许能量产生。由于菌体遭受逆境胁迫时能量需求会增加，而LCAZH_0721（6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因）是磷酸戊糖途径的第1 个限速酶，其功能为将6-磷酸葡萄糖转变为5-磷酸核酮糖，并生成6 分子ATP。因此在低温、低pH 值逆境胁迫条件下的干酪乳杆菌Zhang 通过调整此代谢途径，增加菌体对营养物质的利用，增加ATP 的生成从而维持细胞在逆境胁迫下的活性。LCAZH_1056（磷酸转移酶系统丝氨酸特异性转运蛋白基因） 在PTS 特异性途径中能将葡萄糖从细胞外跨膜主动运输进入细胞，并将葡萄糖磷酸化形成6-磷酸葡萄糖，以参与糖酵解途径。因此，分析逆境胁迫下干酪乳杆菌Zhang 趋向于降低外源物质的向内运输来降低能量消耗以及不良因素对菌体的损伤。LCAZH_1073（UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶） 是在单糖——半乳糖代谢通路（KO00052）、淀粉和蔗糖代谢通路（KO00500）等多种糖的代谢通路中催化α-D-葡糖糖-1-磷酸和UDP-葡糖糖之间互相转化的关键酶。环境胁迫会影响干酪乳杆菌Zhang对外界糖类的利用效率。

2.2.2 氨基酸代谢相关基因差异表达结果与分析与氨基酸代谢相关的基因共3 个，分别为LCAZH_1735、LCAZH_1743、LCAZH_2136，结果如图3所示。

图3表明干酪乳杆菌Zhang 在低温、低pH 值逆境胁迫6 h 后，LCAZH_1735 （阳离子转运酶基因）表达量降低为对照的0.272 倍，与对照相比差异极显著（P<0.01）。胁迫24 h 后表达量降低为0.412 倍，与对照有显著性差异（P<0.05）。胁迫3 d后，表达量降低为0.275 倍，与对照相比差异极显著（P<0.01）。表明逆境胁迫的干酪乳杆菌Zhang会降低外源物质的向内运输。

图3 低温、低pH 值胁迫下氨基酸代谢相关基因表达差异图Fig.3 Gene expression differences in amino acid metabolism at low temperature and low pH condition

LCAZH_1743（D-谷氨酸代谢基因）在胁迫6 h 后表达量降低为对照的0.102 倍，与对照相比差异极显著（P<0.01）。胁迫24 h 后表达量降低为0.377 倍，与对照相比差异显著（P<0.05）。胁迫3 d后表达量降低为0.121 倍，与对照相比差异极显著（P<0.01）。表明菌株降低了D-谷氨酸的代谢表达量。分析是由于低pH 值条件下的菌体细胞内的氨基酸供应不足，细胞倾向于氨的生成和ATP合成，D-谷氨酸转化为碱性的γ-氨基丁酸，以此减少酸胁迫对细胞造成的损伤[22]。

LCAZH_2136（ABC 转运体酶基因）的表达量在胁迫过程中呈现降低趋势，逆境处理6 h 后表达量降为对照的0.712 倍，与对照有显著性差异（P<0.05）。逆境处理24 h 后表达量降为0.346 倍，与对照相比差异极显著（P<0.01）。试验结果证实了干酪乳杆菌Zhang 在低温、低pH 值条件下会降低ABC 转运体ATP 酶的表达。机理可能为酸胁迫使ABC 转运蛋白的活性下降[14]，以此减小逆境胁迫对细胞的损伤。

试验表明，低温、低pH 值逆境胁迫下干酪乳杆菌Zhang 通过调节氨基酸的合成，降低外源物质的向内运输、降低D-谷氨酸的表达以及ABC转运体ATP 酶的表达。LCAZH_1735（阳离子转运酶基因）参与阳离子转运，阳离子转运系统负责外源物质的向内运输，会消耗能量。低温、低pH 值胁迫下干酪乳杆菌Zhang 会降低外源物质的向内运输以减少细胞损伤及耗能反应相关基因的表达。氨基酸是菌株生长过程所必需的营养因素之一。干酪乳杆菌Zhang 中LCAZH_1743（D-谷氨酸代谢基因）控制着D-谷氨酸的代谢。低温、低pH值逆境胁迫下的细胞内氨基酸合成不足[14]，干酪乳杆菌Zhang 通过降低氨基酸的代谢来维持菌体基本生命所需的氨基酸量。LCAZH_2136（ABC 转运体酶基因）参与ABC 转运，可向细胞外转运糖、蛋白质、氨基酸等脂溶性物质，干酪乳杆菌Zhang会通过降低ABC 转运来减弱细胞内外物质的交换，从而减少逆境胁迫所带来的损伤。

2.2.3 细胞膜及脂肪酸合成基因的变化结果与分析 与细胞膜及脂肪酸合成相关的基因共3 个，分别为 LCAZH_1603、LCAZH_2067、LCAZH_2373，结果如图4所示。

从图4看出LCAZH_1603 （磷脂合成蛋白基因）在低温、低pH 值逆境胁迫时表达水平降低。胁迫6 h 后其表达量是对照的0.448 倍，24 h 后为0.526 倍，3 d 后为0.467 倍，均与0 h 的表达水平有显著性差异（P<0.05）。表明干酪乳杆菌Zhang在低温、低pH 值胁迫下会改变饱和脂肪酸磷脂的合成，通过调节膜的脂肪酸含量、分布使细胞膜脂肪酸从饱和向不饱和方向转化是细胞抵御低温、低pH 值逆境胁迫的重要机制[22]。

图4 低温、低pH 值胁迫下细胞膜及脂肪酸代谢相关基因表达差异图Fig.4 Gene expression differences in cell membrane and fatty acid at low temperature and low pH condition

LCAZH_2067 （环丙烷脂肪酸合成酶基因）在逆境胁迫6 h 后表达量增加为1.325 倍，与对照有显著性差异 （P<0.05）。结果表明，干酪乳杆菌Zhang 在低温、低pH 值胁迫下会提高环丙烷脂肪酸的表达量。研究显示，细胞膜环丙烷脂肪酸含量与细胞在低pH 值条件下存活率有关，由于环丙烷脂肪酸可以降低膜流动性并阻止胞外有害物质进入胞内，同时增加环丙烷脂肪酸的含量也是干酪乳杆菌应对酸胁迫的一种应答机制[23]。

LCAZH_2373（短链醇脱氢酶基因）在逆境胁迫时，其表达水平持续降低。6 h 后表达量降为原来的0.547 倍，与对照相比有显著性差异（P<0.05）。24 h 后表达量降到0.494 倍，胁迫3 d 后则降至0.370 倍，与对照相比差异极显著（P<0.01）。结果表明，干酪乳杆菌Zhang 在低温、低pH 值胁迫下会降低短链醇脱氢酶的表达量。这和降低短链脂肪酸合成、增加脂肪酸的链长是干酪乳杆菌的一种存活机制的结论相吻合[20]。

细胞膜不仅作为细胞抵御环境胁迫的第一道屏障，乳酸菌在面临酸、冷胁迫时，细胞膜的脂肪酸含量、分布和组成都发生着变化，这些变化主要通过改变细胞膜的流动性来适应细菌所在的不良环境[24]。改变细胞膜脂肪酸的成分是调节细胞膜流动性的一种方式，同时也是细胞应对逆境胁迫的一种应对机制。试验表明低温、低pH 值胁迫下干酪乳杆菌Zhang 通过增加不饱和脂肪酸合成、降低饱和脂肪酸合成来增加膜脂的不饱和度；增加膜脂碳链长度使其更容易横跨膜双分子层，进而与其它的脂类和蛋白通过疏水作用结合，使脂肪酸链更紧凑，使膜环境更接近于“凝胶状”，从而增加了膜的稳定性，维持了细胞的活性[23]。环丙烷脂肪酸同样也会调节细胞膜的流动性，干酪乳杆菌Zhang 提高环丙烷脂肪酸的表达量也是一种存活机制。

2.2.4 应激蛋白相关基因差异表达结果与分析与应激蛋白相关的基因共2 个，分别为LCAZH_1495、LCAZH_2207，结果如图5所示。

图5 低温、低pH 值胁迫下应激蛋白基因表达差异图Fig.5 Gene expression differences in stress protein at low temperature and low pH condition

由图5得出LCAZH_1495（DNA 引发酶基因）在逆境胁迫6 h 后表达量下降为对照的0.630 倍，24 h 后降为0.726 倍，3 d 后降为0.692 倍，均与对照有显著性差异（P<0.05）。而LCAZH_2207（分子伴侣Gro EL 基因） 胁迫24 h 后增加至1.233 倍，与对照有显著性差异（P<0.05）。此现象是由于细胞内pH 值的下降会使蛋白质在折叠时发生错误，导致DNA 等生物大分子受到损伤[21-22]。为了修复损伤、提高抵抗酸胁迫的能力，细胞会表达一些应激蛋白[25]。根据蛋白组学分析，酸胁迫下的乳酸菌会诱导细胞表达包括Gro ES，Gro EL 等在内的33 种热休克蛋白[10]。而且酸胁迫会导致DNA 合成、转录和翻译等途径中的相关蛋白表达下调。试验与预计结果相符，证明了干酪乳杆菌Zhang 在低温、低pH 值胁迫时，DNA 引发和复制会降低，分子伴侣表达量会增加。

试验表明，低温、低pH 值逆境胁迫下干酪乳杆菌Zhang 过量表达应激蛋白Gro EL 并减弱DNA 复制相关基因的表达。LCAZH_2207（分子伴侣Gro EL 基因） 是较早发现的一类应激蛋白，具有修复或解折叠损伤蛋白质的生物学功能。研究表明Gro EL 蛋白与菌体对低pH 值、冷激等不良环境的应激反应或抵御能力有关[26]。逆境胁迫下应激蛋白Gro EL 的高表达可能通过参与细胞能量水平的调节，使菌株能够在不良环境下生存，或者通过保护和修复系统等功能来保护细胞免受酸胁迫。这与本试验的结果相一致，表明干酪乳杆菌Zhang 在低温、低pH 值逆境胁迫时会通过减少DNA 复制、增加分子伴侣合成来应对不良环境。

3 结论

本研究在转录水平上利用实时荧光定量PCR技术对低温、低pH 值逆境胁迫下干酪乳杆菌Zhang 的差异表达基因进行分析，成功监测到12个基因的差异表达变化，主要涉及糖代谢、氨基酸代谢、细胞膜及脂肪酸以及应激蛋白合成等。在应对低温、低pH 值的逆境胁迫时，推测干酪乳杆菌Zhang 会发生全局性响应，通过增加乳酸的消耗、乳酸的转移来缓解H+的胁迫，通过增加ATP 的生成、内源糖原的合成来维持细胞的正常生命活动；通过降低相关氨基酸的合成减少胞外有害物质进入胞内以及胞内大分子流出来降低损害、应对不良环境；通过增加不饱和脂肪酸磷脂的合成以及脂肪酸的链长来维持细胞膜的流动性，通过增加环丙氨脂肪酸的合成来适应低pH 值环境；通过增加应激蛋白Gro EL 来修复不良环境下DNA 的损伤，通过降低DNA 的复制减少细胞分裂等来降低能量消耗进而维持细胞基本生命活动以应对低温、低pH 值的逆境胁迫。