烹饪方式对重组鱼排质构及体外模拟消化的影响

孟 粉，秦求思，董 烨，毛海萍，戴志远，2，3*

烹饪是将食材经一系列的加工转化为食物的过程，使食物富有色、香、味、形、质等。我国自古就有很多烹饪方式，包括炒、爆、炸、烹、煎、贴、烧、焖、炖、蒸等26 种。食材经烹饪后，不仅通过高温杀死致病菌提高食品的安全性，而且赋予食物独特的风味，促进蛋白质变性等[1]。目前主要的加工方式是水煮、汽蒸、油炸、微波、烤制、煎制等，而不同的加工方式会影响食物的质构和消化特性。

鱼类营养价值高，可为人们提供优质蛋白和不饱和脂肪酸[2-3]。草鱼属“四大家鱼”之一，其养殖技术在我国已经非常成熟，产量、产值在世界淡水养殖鱼类中排名第一[4]。目前市场上草鱼的食用方式主要有：直接烹饪、腌制鱼干、鱼糜类制品，这3种加工方式各有利弊。直接烹饪既可以保证鱼类的新鲜度，又可以选择自己喜欢的烹饪方式，然而需要花费大量的时间。腌制鱼干过程中会产生亚硝酸盐等对人体有害物质，腌制亦会使蛋白质变性，使鱼肉制品变硬，失去鱼肉原有的嫩滑[5]。鱼糜类制品主要是鱼丸、模拟蟹棒、鱼糕等[6]，为使此类产品凝胶强度更好，往往会在加工过程中加入较多的植物蛋白，而完全吃不到鱼肉的质感，也不能为人们提供优质蛋白质。

重组鱼排是目前较新颖的一种加工方式[7]，既能保持鱼肉的质感，又能满足大部分人群的食用需求；重组鱼排是利用谷氨酰胺转氨酶（glutamine transaminase，TGase） 促进蛋白质凝胶网络结构的形成，从而提高制品质构特性的新型加工方式[8]。TGase 是一种生物类催化剂，被广泛应用于食品加工中，其能够催化鱼肉肌球蛋白中的谷氨酸（Glu）-γ-羧基酰胺基与赖氨酸（Lys）的ε-氨基发生共价交联作用，从而形成分子间或分子内的非二硫共价键，提高制品的凝胶特性[9]。Liang 等[10]研究发现加入TGase 可以改善混合凝胶的性能。孟林等[11]研究发现鸭胸肉糜中加入一定量的TGase，可以提高重组鸭胸肉的保水性和质构特性。郝凤霞等[12]研究发现适量添加TGase，能够改变蛋白质构象，提高肉样的保水性。张怡洁等[13]研究带鱼纯鱼肉重组制品蛋白质体外模拟消化时，发现TGase组样品中蛋白质体外消化率比对照组高。焦阜欣等[14]研究鱼糜凝胶体外消化时，发现TGase 的加入有利于胃、肠的消化。

不同烹饪方式会影响食物的硬度、弹性、咀嚼性等，且会导致食物中蛋白质和脂肪发生不同程度的变性和氧化，从而影响食物的消化性。探究不同加工方式对重组草鱼碎肉的质构特征和体外模拟消化特征是有必要的。王军等[15]研究发现热处理后猪肉中蛋白质的消化率增加；张丹等[16]研究发现蒸煮后蛋白质消化率显著提高。路红波等[17]研究发现热塑挤压蒸煮处理方法比传统热加工处理方法更能提高鱼肉蛋白质的消化率。本研究制备不同交联程度的鱼排，通过水煮、汽蒸、微波、油炸4 种方式进行烹饪，再利用质构仪测定其质构特性，最后通过模拟口-胃-肠消化来研究不同烹饪方式及酶对其消化性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活草鱼、NaCl（食品级），购于杭州教工路物美超市；谷氨酰胺转氨酶（食品级），江苏一鸣生物有限公司；黏蛋白酶、过氧化物酶等（生物试剂），美国Sigma 公司；胃蛋白酶、胰酶等（生物试剂），国药集团化学试剂有限公司；KCl、KSCN、NaHCO3等（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；BCA 试剂盒（生物试剂），碧云天生物技术有限公司；考马斯亮蓝R250、SDS、Tris、Acr、Bis 等（电泳级），伯乐生命医学产品（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平（BSA124S-CW），赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；恒温水浴锅（JOANLAB），宁波市群安实验仪器有限公司；美的多功能电磁炉，美的集团有限公司；凯氏定氮仪（Kjeflex K-360），瑞士Buchi 公司；酶标仪（SPECTRA MAX190），美国分子仪器有限公司；分光测色仪（CQX：3111），美国Hunter 公司；质构仪（TMS-Pro），美国FTC 公司；垂直电泳仪（BIO-RAD），伯乐生命医学产品（上海）有限公司；高效液相色谱仪（e2695），美国Waters 公司；均质机（FJ200-S），上海力辰科技有限公司；台式高速冷冻离心机（ROTINA 420R），德国ILETTICH 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼肉前处理 将鲜活草鱼宰杀后，去头、去皮、去尾、去内脏，然后进行采肉。采下来的鱼肉先用4 ℃冰水漂洗3 次，再用0.15%盐水漂洗1 次，促进鱼肉脱水。经盐水漂洗后的鱼肉放入聚乙烯包装袋中存于-18 ℃冰箱，1 周内使用。

1.3.2 样品制备 对照组样品：每100 g 草鱼碎肉中加入2.0% NaCl，机器混匀，入模后40 ℃水浴凝胶3 h；试验组样品：每100 g 草鱼碎肉中加入2.0% NaCl 和1 U/g TGase，机器混匀，入模后40 ℃水浴凝胶3 h，然后放入4 ℃冰箱过夜，并将其分成9 组：新鲜鱼肉样品、水煮无TGase 样品、水煮有TGase 样品、汽蒸无TGase 样品、汽蒸有TGase样品、微波加热无TGase 样品、微波加热有TGase样品、油炸无TGase 样品、油炸有TGase 样品。当样品中心温度达到80～90 ℃时视为结束点，所有样品一式三份。

1）水煮：将重组鱼排样品放入沸水中，水浴10 min 后取出，吸干表面水分。2）汽蒸：将重组鱼排放在带孔不锈钢蒸笼上，将蒸笼放入沸腾的锅中，蒸制10 min，结束后取出吸干表面水分。3）微波：将重组鱼排放入微波炉专用盘中，再放入微波炉中加热。档位设置为中火，加热2 min，取出后翻面再加热2 min，结束后取出吸干表面水分。4）油炸：将重组鱼排放入预先加热的沸油中，油炸5 min，结束后吸干表面多余的油分。

1.3.3 体外模拟消化模型 参考Van Hecke 等[18]和胡吕霖等[19]模拟消化液配制方法，进行一定的修改，具体如表1所示。称取5 g 重组鱼排样品，加入10 mL 模拟唾液，均质30 s，37 ℃水浴消化5 min；再加入15 mL 模拟胃液（含胃蛋白酶），调pH值到2.0±0.2 后37 ℃水浴1 h，每隔10 min 摇匀1次；最后加入15 mL 模拟肠液（含胰蛋白酶），调pH 值到8.0±0.2 后37 ℃水浴2 h，每隔10 min 摇匀1 次。消化结束后进行灭酶，条件为100 ℃水浴5 min，待冷却后加入15 mL 无水乙醇，4 ℃冰箱冷藏过夜后，8 000 r/min 离心20 min，分别留取口消化后、胃消化后及经过整个消化过程的上清液和沉淀，存于-80 ℃超低温冰箱待用，每个样品重复3 次消化试验。

表1 模拟消化液（唾液、胃液、肠液）成分Table 1 Compositions of digestive juices used for in vitro digestion of fish samples

1.3.4 基础成分分析

1.3.4.1 水分含量 参考国标GB 5009.3-2016《食品中水分的测定》中直接干燥法测定。称取约2 g 样品，平铺于培养皿中，置于105 ℃烘箱中，烘至恒重后称重。每个样品重复试验3 次，取平均值。

1.3.4.2 蛋白质含量 参考国标GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法测定。精确称取0.2000 g 样品于消化管中，加入6 g 硫酸钾，0.4 g 硫酸铜，10 mL 浓硫酸，放入消化炉中，先于130℃消化30 min，然后250 ℃消化1 h，待消化结束后冷却至室温，利用全自动凯氏定氮仪测定。每个样品重复试验3 次，取平均值。

1.3.4.3 脂肪含量 参考Folch 等[20]方法，称取5 g 样品，加入50 mL 二氯甲烷-甲醇（体积比2∶1）溶液，振荡均匀，超声20 min，加入10 mL 双蒸水，4 ℃离心10 min（8 000 r/min）取底层液体进行氮吹，吹干后称重。每个样品重复试验3 次，取平均值。

1.3.4.4 灰分测定 参考国标GB 5009.4-2016《食品中灰分的测定》中食品中总灰分的测定。每个样品重复试验3 次，取平均值。

1.3.5 重组鱼排质构测定 利用质构仪中TPA程序进行测定。重组鱼排经不同方式烹饪后，切成2 cm×2 cm×2 cm 的正方体，采用P5 圆柱形探头测定凝胶强度，平行3 次。TPA 参数设置如下：测试速度：60 mm/min；触发力：0.1 N；形变量：70%。分别记录硬度、内聚性、弹性、胶黏性和咀嚼性。

1.3.6 体外消化率

1.3.6.1 干物质消化率 参考Fang 等[21]的方法，分别称取1 g 消化前的样品和1 g 消化后的样品，置于105 ℃烘箱中，烘至恒重，称量，干物质消化率计算公式如下：

式中：W0——消化前的干物质含量，g；W1——消化后的干物质含量，g。

1.3.6.2 蛋白质消化率 参考刘萍等[22]的方法，取消化前和消化后样品各5 g 左右，于50 ℃烘至恒重。然后分别取消化前烘干样品和消化后烘干样品进行凯氏定氮，方法参考1.3.4.2 节。蛋白质消化率计算方程如下所示：

式中：DT——蛋白质体外消化率，%；W0——消化后烘干沉淀物中蛋白质的含量，g；W1——消化前肉样中蛋白质的含量，g。

1.3.6.3 BCA 蛋白浓度 参考李黎[23]的方法，消化后上清液中蛋白质浓度用BCA 试剂盒测定。向96孔酶标板中加入200 μL 的反应液和20 μL 待测样品或样品稀释液。以全蛋白提取液在562 nm 下吸光度为空白对照。每个样品平行测定3 次。

1.3.7 消化产物的高效液相色谱分析 参考焦阜欣等[14]的方法，采用RP-HPLC 技术分析不同加工方式样品的消化产物。根据消化后样品极性进行分离，极性越强的分子出峰保留时间越短，柱子选用C18 柱。色谱条件如下：流动相A：含0.1%三氟乙酸的水；流动相B：含0.1%三氟乙酸的乙腈；色谱柱：XBridgeC18，150 mm×4.6 mm，5 μm；进样量：15 μL；流速：1 mL/min；检测波长：220 nm；洗脱程序：0～5 min 流动相B 为0%，5～30 min 流动相B从0%到40%，30～35 min 流动相B 从40%到95%，35～40 min 流动相B 从95%到0%，40 min 停止。

1.3.8 蛋白电泳分析 参考Wasson 等[24]的方法进行蛋白质电泳，称取3 g 左右的重组鱼排样品及消化后样品，加入27 mL 5%的SDS 溶液和27 μL的β-巯基还原剂，均质2 min，在80 ℃水浴条件下作用2 h。4 ℃离心20 min（8 000 r/min）取上清液，进行SDS-PAGE 电泳。选用10%分离胶和4%浓缩胶，上样量为10 μL，前30 min 电压为70 V，之后调为110 V 至电泳结束，用考马斯亮蓝R250 染色40 min，倒出染色液，加入适量脱色液，脱色40 min 后，更换脱色液，继续脱色过夜。

1.4 数据分析

作图采用Oringin 8.0 软件，平均值、标准差和显著性水平均采用SPSS 21.0 和Excel 2013 软件计算，显著性分析的置信区间为95%。

2 结果与讨论

2.1 基础成分分析

由表2可知，新鲜草鱼的基础成分含量与吴涛[25]、林亚楠[26]测定结果相似。加工方式和TGase对水分含量影响显著（P<0.05）；其中汽蒸样品水分含量最高，微波加热和油炸会使水分含量损失较多，微波加热的机理是微波能作用于极性分子，水分子属于极性分子，在微波能的作用下，水分子会逸出，导致水分含量下降，这与薛长风等[27]研究结果一致；而油炸过程中，由于高温环境下，水分从鱼排表面迅速蒸发，从而使鱼排呈现出较低的水分含量[28]。由于各种加工方式使水分含量均减少，因此蛋白质、脂肪、灰分含量略微有所增加；其中油炸处理的样品脂肪含量最高，这可能是因为高温油炸会使鱼排产生较多孔径，冷却过程中内外压力改变较大，增加了鱼排表面和内部的压力差，从而增加了油脂吸入驱动力[29]。

表2 基本成分含量表Table 2 Proximate composition of samples

含有TGase 的样品经水煮、汽蒸、微波处理后水分含量均大于不含TGase 的样品，这可能是因为TGase 使草鱼鱼肉凝胶形成更好的三维结构，锁住大量水分；无论是否含有TGase，样品经过不同加工方式处理后，其蛋白质、脂肪、灰分含量相差不大。

2.2 重组鱼排质构分析

表3列出了各样品质构参数包括：硬度、内聚性、弹性、胶黏性和咀嚼性。其中油炸样品的硬度最高，在高温油炸过程中，鱼排的水分损失较大，且鱼肉肌纤维受热紧密，因此会使其硬度增加，这与薛冬梅等[30]研究结果一致；水煮样品的弹性最好，可能是因为水煮样品受热均匀，且温度没有其它加热方式高，对蛋白质高温变性影响较小，而高温油炸弹性较小，可能是因为油炸过程使蛋白质三维结构遭到破坏。TGase 的添加使样品的硬度、弹性、胶黏性和咀嚼性均增加，这与María 等[31]研究结果一致；加入TGase 会使蛋白质交联程度增加，从而使其硬度增加，且TGase 的加入可以促进蛋白质分子内和分子间形成三维结构，从而提高重组鱼排的弹性、胶黏性、咀嚼性[32]。

表3 不同处理方式对质构特性的影响Table 3 Effect of different treatment methods on the texture characteristics

2.3 体外消化率分析

不同加工方式处理的重组鱼排经过三步消化后的消化率测定结果如表4示。在三步消化过程中，干物质消化率、蛋白质消化率及BCA 蛋白浓度均增加，其中口腔消化率最低，其次是胃，消化率最高的是小肠。鱼肉蛋白质在人体中会先被胃消化，然后在小肠中被进一步消化和吸收，这与沈艳奇[33]研究结果一致。其中，新鲜鱼肉体外消化率较加工后高，可能是因为新鲜鱼肉蛋白质分子聚集性小，在各消化液中其蛋白质易被分解，而重组鱼排在加入NaCl（或TGase）后，其蛋白质分子发生不同程度的聚集，被不同程度修饰[34]，蛋白分子质量越大越难被消化。不同加工方式对重组鱼排体外消化率有影响，微波和油炸处理后的样品经过整个消化过程后，其体外消化率较低。造成这一现象的原因可能是加热处理后重组鱼排蛋白质发生变性，例如蛋白质分子内及分子间的伸展、重组等，可能使胃蛋白酶和胰酶作用位点被隐藏[35]。不含TGase 的样品均比含有TGase 样品体外消化率高，这是因为TGase 可极大地促进蛋白质肌原纤维重链的交联，从而形成高分子质量的聚集物[36]，导致含有TGase 的重组鱼排对胃蛋白酶和胰酶有一定的抗性。

表4 样品模拟体外消化率Table 4 Simulated in vitro digestibility of the sample

2.4 消化产物的高效液相色谱分析

2.4.1 模拟口腔消化结果 将模拟口腔消化后的上清液过0.45 μm 膜后，通过高效液相色谱柱进行分离；由图1可知各样品经过模拟口腔消化后峰形相似，但新鲜鱼肉明显比其它样品消化率高，这与前文体外消化率测定的结果一致；各样品在10 min 附近均有1 个小峰出现，因保留时间相对较短，因此可能是一些极性很强的分子，在16～18 min 附近均有两个小峰出现，22 min 附近有出峰趋势；由图可知，烹饪方式和TGase 对重组鱼排模拟口腔消化影响不大。

图1 口腔消化后的高效液相图谱Fig.1 The chromatogram of high performance liquid after oral digestion

2.4.2 模拟胃消化结果 将模拟胃消化后的上清液过0.45 μm 膜后，进高效液相色谱柱进行分离；由图2可知各样品经过模拟胃消化后峰形依然相似，但新鲜鱼肉消化率明显高于其它样品；在18～28 min 附近出现1 个较大的峰，由此可知经过胃消化后产生了较多的极性相对较弱的分子，可能是因为胃蛋白酶主要作用于疏水性氨基酸，例如丙苯氨酸、色氨酸、酪氨酸等[37]；由图可知，水煮类样品消化率最高，油炸类样品消化率最低，且水煮样品中无TGase 的消化率比添加TGase 的消化率高，这与前文研究结果一致。

2.4.3 模拟肠道消化结果 将模拟肠消化后的上清液过0.45 μm 膜后，进高效液相色谱柱进行分离；由图3可知各样品经过肠模拟消化后峰形依旧相似，且比图2中的峰更高，这说明胃蛋白酶和胰酶对蛋白质作用位点的不同；14～15 min 之间存在峰形的差异，新鲜鱼肉样品峰向下，而其它样品峰向上，且新鲜鱼肉样品最高峰的保留时间较长，这可能是因为新鲜鱼肉样品没有加入NaCl 和TGase，蛋白质没有发生交联，有较多氨基酸暴露，而胰蛋白酶主要作用于赖氨酸和精氨酸，TGase主要作用于肌球蛋白中的谷氨酸-γ-羧基酰胺基与赖氨酸的ε-氨基发生共价交联，减少了胰蛋白酶作用的位点[14]。从高效液相图谱可观察到不同烹饪方式下整个消化过程中分子分离情况，口-胃-肠消化图谱相比，口消化后峰最低、峰面积最小，肠消化后峰最高、峰面积最大，表明肠消化后的消化率最高，这与测定的模拟体外消化率结果相吻合。

图2 胃消化后的高效液相图谱Fig.2 The chromatogram of high performance liquid after pepsin digestion

图3 模拟肠道消化后的图谱Fig.3 The chromatogram of high performance liquid after gastrointestinal digestion

2.5 凝胶电泳图谱分析

由图4可知，在整个消化过程中，蛋白质分子质量逐渐变小。图4a 是消化前各样品SDS-PAGE电泳图谱，由图可知，新鲜鱼肉在200 ku 的肌原纤维蛋白重链（MHC） 上呈现明显的条带，含有TGase 的样品在200 ku 附近条带减弱甚至消失，这说明大部分的TGase 反应发生在肌球蛋白重链上即分子质量为200 ku，这与Herranz 等[38]研究结果一致。图4b 是经过模拟口腔消化后的样品图谱，由图可知44.3 ku 附近的蛋白质分子明显比消化前增多，44.3 ku 以下的条带更加明显，这说明口消化后一小部分大分子物质会被分解。图4c 是经过模拟胃消化后的样品电泳图谱，微波和油炸处理后的样品在44.3 ku 附近含量较高，说明其胃消化率较低，这与前文研究结果一致。图4d 是经过模拟肠消化后样品电泳图谱，由图可知经过模拟肠消化后，蛋白质分子变成了多肽，汽蒸和水煮样品仍存在一些低分子质量的条带，这说明烹饪方式会影响最终消化产生多肽的含量，这与胡吕霖等[19]研究结果一致。

图4 SDS-PAGE 电泳图谱Fig.4 The Tricine-SDS-PAGE pattern

3 结论

本试验研究了烹饪方式及TGase 对重组鱼排基础成分、质构及体外模拟消化的影响。其中基础成分分析结果表明：含有TGase 的样品经水煮、汽蒸、微波处理后水分含量均大于不含有TGase 的样品，各样品蛋白质、脂肪、灰分含量均比新鲜鱼肉高，油炸处理后的脂肪含量最高。质构测定结果表明：油炸样品硬度最高，水煮样品弹性最好，TGase 的加入可使硬度、弹性、胶黏性和咀嚼性均增加。模拟体外消化结果表明：微波加热和油炸样品消化率较另外两组偏低，高效液相结果显示不同消化步骤的峰图有明显的不同，但不同烹饪方式及酶对消化产物峰图影响不大，这表明加入TGase 不会明显影响样品的消化率；SDS-PAGE 电泳图谱显示了整个消化过程中分子质量逐渐变小。