鲤鱼来源乙酰胆碱酯酶的高效表达及分子对接模拟

卢海强，陈 伟，黄 蕾，谷新晰，田洪涛

目前，有机磷类 （organophosphorus insecticides，OPs）和氨基甲酸酯类（carbamate insecticides，CBs）农药的不合理使用已严重威胁到农产品的质量安全[1-3]。如何快速、灵敏及低成本的检测农副相关产品的农药残留，对于保障我国的食品安全具有重要的现实意义。目前测定有机磷和氨基甲酸酯类农药的方法主要有3 类，分别是色谱法[4]、免疫法[5]和酶抑制法[6]。其中酶抑制剂法检测成本较低，可用于农副产品生产的现场检测，成为最有发展潜力的检测方法，而乙酰胆碱酯酶是酶抑制法的核心材料。乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，E.C.3.1.1.7）是生物神经传导中的关键酶，也是有机磷和氨基甲酸酯类农药作用的靶位点[7-8]。当前，酶抑制剂法推广的瓶颈主要是较高的酶制剂生产成本及酶对有机磷农药所表现出的较低的敏感性。

一般来说，酶制剂发展可分为3 个阶段：第1阶段是酶制剂主要从动物、植物和微生物体中直接提取[9-10]；第2 个阶段是利用基因工程技术实现酶基因的高效表达，摆脱原材料的束缚，降低酶的生产成本[11-12]；而第3 个阶段主要是对酶制剂分子进行改造，使它的催化效率、稳定性及酶学性质向着有利于实际应用需求的方向改变，称为酶的分子进化[13]。目前，乙酰胆碱酯酶处于第1 阶段发展末期和第2 阶段初期的过渡阶段，即大量的乙酰胆碱酯酶主要从生物体直接提取获得，而该类方法获得乙酰胆碱酯酶产量低、成本高，难以满足检测的需要。目前，众多科研工作者对多种物种如鱼、家蚕和菜叶蛾等来源的乙酰胆碱酯酶基因进行克隆表达[14-16]，发现它们对有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感性存在较大差异，其中鱼源乙酰胆碱酯酶表现出较好的应用潜力[17-18]。2009年，Sato等[19]选用pPICZα A 载体和P.pastoris X-33 宿主完成了对鲤鱼来源的乙酰胆碱酯酶基因的克隆表达，然而，酶的表达量偏低（181 mU/mL ± 31 mU/mL）。2019年，Liang[20]等采用细胞表面展示技术对CpAChE 进行研究，取得较好的效果，然而，该酶表达量不高的问题依然制约其在食品农药残留检测中的应用。

本研究以鲤鱼乙酰胆碱酯酶基因（CpAChE）为研究对象，依据毕赤酵母的密码子偏好性对该基因进行密码子优化，获得乙酰胆碱酯酶优化基因CpAChEopt。采用pPIC9K 及毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115 表达系统进行高效表达。通过对重组CpAChE 的酶学性质表征及其对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感性的研究，为乙酰胆碱酯酶在食品农药残留检测中的应用提供依据。利用分子对接模拟重组乙酰胆碱酯酶与克百威的作用，寻找潜在的结合残基，为后续酶的定向改造提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Easy Taq DNA 聚合酶、dNTPs（2.5 mmol/L）、T4 DNA 连接酶和限制性内切酶Ecol I、Not I 和BglⅡ，TaKaRa 公司；质粒小提中量试剂盒、DNA回收试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）、典化硫代乙酰胆碱，索莱宝生物科技有限公司；有机磷农药、氨基甲酸酯类农药，农业农村部环境保护科研监测所；其它化学试剂为分析纯。

1.2 菌株、质粒和培养基

巴斯德毕赤酵母GS115、质粒pPIC9k 和大肠杆菌DH5α 由本实验室保藏。

LB 培养基：蛋白胨10 g，酵母抽提物5 g，NaCl 1 g，pH 7.0，定容至1 L，灭菌备用。

YPD 培养基：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，定容至1 L，灭菌备用。

BMGY 培养基：蛋白胨20 g/L，酵母抽提物10 g/L，磷酸钾缓冲液 （pH 6.0，100 mmol/L），YNB 13.4 g/L，0.016 μmol/L 生物素，甘油10 g/L。

BMMY 培养基：蛋白胨20 g/L，酵母抽提物10 g/L，磷酸钾缓冲液 （pH 6.0，100 mmol/L），YNB 13.4 g/L，0.016 μmol/L 生物素，甲醇10 g/L。

1.3 方法

1.3.1 乙酰胆碱酯酶基因的优化与合成 为提高乙酰胆碱酯酶（AChE）在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达量，依据密码子使用数据库（http：//cazusa.or.jp/codon）信息，优化乙酰胆碱酯酶基因（AB361595）低频氨基酸密码子（<10‰），且对基因各区段GC 含量进行优化，使GC 含量均保持在50%左右。在目的基因5' 端和3' 端分别添加EcoR I （GAATTC） 酶切位点和Not I（GCGGCCGC）酶切位点，优化后的乙酰胆碱酯酶基因（CpAChEopt）由金斯瑞生物科技公司合成。

1.3.2 重组菌株的构建 分别将pUC57-CpAChEopt 质粒和pPIC9K 质粒进行双酶切（EcoR I 和Not I），利用胶回收试剂盒对酶切产物进行回收，并进行CpAChEopt 和pPIC9K 片段的连接反应，构建重组质粒pPIC9K-CpAChEopt，将连接产物转化至DH5α 感受态中。采用通用引物5’AOX 和3’AOX 对转化子进行菌液PCR 验证，将阳性转化子送至北京中科希林生物科技有限责任公司进行测序。将测序正确的菌株进行培养，利用质粒提取试剂盒提取重组质粒pPIC9KCpAChEopt，使用限制性内切酶Bgl Ⅱ对重组质粒pPIC9K-CpAChEopt 进行线性化，线性化产物电转化至P.paster GS115 宿主中，参照毕赤酵母表达手册进行阳性转化子的筛选。

1.3.3 重组菌株诱导表达及SDS-PAGE 分析 挑取阳性转化子至YPD 培养基（50 mL）中培养12 h（30 ℃，250 r/min）后，取2 mL 转接至200 mL BMGY 中，在摇床30 ℃培养48 h 后（8 000 g 离心10 min 收集细胞） 重悬于100 mL 甲醇体积分数为0.5%的BMMY 培养基中诱导72 h，每间隔24 h补加甲醇，离心收集发酵液，即为粗酶液，进行后续试验分析。

1.3.4 乙酰胆碱酯酶活性的测定 酶活测定参照Ellman 等[21]的方法并进行适当调整：取50 μL 适当稀释的酶液和50 μL 碘化硫代乙酰胆碱，在pH 8.0（磷酸盐缓冲液，0.1 mol/L）的缓冲液中，25 ℃反应10 min 后，加入50 μL 的SDS（10%）溶液终止反应，随后加入50 μL DTNB（2 mmol/L）进行显色，显色稳定后在波长412 nm 处测定吸光值。

酶活单位（IU）：以每分钟水解1 μmol 碘化硫代乙酰胆碱的酶量定义为1 个酶活单位（IU）。

1.3.5 重组乙酰胆碱酯酶的酶学性质测定

1.3.5.1 pH 值对重组酶活性的影响 将重组乙酰胆碱酯酶酶液分别在pH 5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5 和9.0 条件下进行催化反应，测定重组酶CpAChE 的酶活力，以酶活力最高值为100%计算，分析该酶的pH 值反应范围。将重组酶CpAChE 在pH 2.0～12.0 的条件下，0 ℃处理1 h，对照组为未进行处理的酶，参照1.3.4 节方法测定酶活力，以酶活力最高值为100%计算分析其pH值耐受性。

1.3.5.2 温度对重组酶活性的影响 将重组酶CpAChE 在最适pH 值下，分别在10，20，25，30，35，40，45 ℃的温度条件下测定重组酶CpAChE 的酶活力，以酶活力最高值为100%计算，分析该酶的温度反应范围。将重组酶在15，25，35，45 ℃的温度条件下，孵育0，10，20，30，60 min 后，测定剩余酶活力，以酶活力最高值为100%计算分析其热稳定性。

1.3.5.3 有机试剂及金属离子对重组酶活性的影响 在最适合反应条件下，分别测定丙酮、乙醇、尿素、CTAB、吐温、SDS 和9 种金属离子下的CpAChE 酶活力，探究化学试剂和金属离子对酶活性的影响，为该酶的应用提供必要的指导。

1.3.6 重组酶农药敏感性和动力学参数的测定农药敏感性试验参考何绍志等[22]方法：取50 μL适当稀释酶液，25 μL 碘化硫代乙酰胆碱溶液（8 mmol/L）和75 μL 不同浓度农药溶液（pH 8.0）混合均匀，25 ℃反应10 min 后，加入50 μL 的SDS（10%）溶液终止反应，随后加入50 μL 的DTNB（2 mmol/L）进行显色，显色稳定后在412 nm 处测定吸光值ΔAx。对照为不添加农药的标准酶活测定值ΔA0。根据下式计算抑制率：（ΔA0-ΔAX）/ΔA0×100%，并计算农药对CpAChE 的抑制中浓度IC50。配制0.5，1，2，4，8，10 mg/mL 的ATCHI 底物溶液，依据Lineweaver-Burk 双倒数法计算动力学参数Km及Vmax。

1.3.7 重组酶与克百威的分子对接 利用BLAST 程序从NCBI 的蛋白质结构数据库中找到与CpAChE 序列相似且结构已知的乙酰胆碱酯酶，将其结构作为模板，利用Discovery studio 2.5中的MODELER module 模块对CpAChE 进行同源建模；并用PROCHECK、ERRAT 和ProSA 软件对所得模型的质量进行评估，获得CpAChE 的三维结构模型。从NCBI 网站化学结构数据库（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov） 获得小分子克百威（CID：2566，MF：C12H15NO3）的结构，用Autodock中的Libdock 模块进行分子对接，采用Pymol 软件进行对接模型的可视化分析。

1.3.8 数据分析及处理 每次试验平行测定3次，利用Excel 2010 和SPSS 19.0 等软件进行数据统计分析，数据结果采用平均值±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 乙酰胆碱酯酶基因分析

乙酰胆碱酯酶基因（CpAChE）经密码子优化后，GC 含量由33%～66%调整为45%～55%范围内，密码子适应指数（CAI）由0.67 优化为0.88，优化前后的序列一致性为77%。乙酰胆碱酯酶CpAChE 由前22 氨基酸的信号肽和催化区域组成，其中胆碱结合位点为Trp108，推测该酶分子可形成3 对二硫键，分别是Cys 91-Cys 118、Cys 275-Cys290、Cys 427-Cys580。大多数乙酰胆碱酯酶在C 端含有T 肽，主要起连接各个单链分子形成聚合物体的作用，而大量证据表明，T 肽结构阻碍基因的异源高效表达[23]。

2.2 重组酶的诱导表达及SDS-PAGE 分析

参照毕赤酵母表达手册要求进行重组菌株的培养和诱导表达。经测定，发酵上清液的乙酰胆碱酯酶酶活为7.4 U/mL，是Sato 等[19]报道的该酶表达量的40 倍，这表明利用密码子优化实现了酶的高效表达。酶液经SDS-PAGE 分析，结果如图1所示。在约50 ku 处出现目标蛋白条带，而这与CpAChE 的蛋白理论分子质量（66.84 ku）存在一定的差异。这很可能与P.pastoris GS115 菌株所分泌内源性蛋白酶降解有关。经分析，该氨基酸序列存在3 个“Lys-Arg”蛋白酶酶切位点和3 个“Arg-Arg”蛋白酶酶切位点。该蛋白分子经Endo H 处理后，片段大小并未发生变化，表明N 糖基化并未对该酶进行后修饰加工。

图1 重组乙酰胆碱酯酶CpAChE 的SDS-PAGE电泳分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant CpAChE

2.3 重组酶CpAChE 酶学性质分析

参考周思多等[23]的报道，以SDS 为终止剂开展重组酶CpAChE 的酶学性质研究，结果如下。经测定（图2a），重组酶CpAChE 的最适反应pH 值为8.0，当pH 值低于5.0 时，该酶活性无法被检测到。由于当pH 值大于9.0 之后，底物降解所造成的本底干扰非常严重，因此碱性条件下的乙酰胆碱酯酶活性还需进一步探究。经pH 稳定性测定（图2b），发现该酶在碱性条件（pH 7.0，11.0）下能使酶活性保持在95%以上，相对稳定，而该酶在pH 2.0，6.0 处理1 h 后，CpAChE 剩余酶活性低于80%，且随着pH 值的降低而减弱。重组酶CpAChE 的最适反应温度为25°C，其活性反应温度范围为10～45°C（图2c），结果表明该酶非常适合常温反应。重组酶CpAChE 在15 ℃和25 ℃条件下，处理1 h 酶活性保持不变，活力稳定 （图2d）。随着温度的提高，该酶的稳定性越来越差，在35 ℃处理1 h 后，CpAChE 相对酶活仅损失20%，而45 ℃处理20 min 后，CpAChE 活性完全丧失。

图2 乙酰胆碱脂酶CpAChE 的酶学性质分析Fig.2 The characterization of recombinant CpAChE

2.4 化学试剂及金属离子对重组酶活性的影响

酶在实际应用时，除了受自身的性质影响外，往往受到具体的环境因素的干扰，而化学试剂及金属离子就是比较重要的外界因素。由表1可知，多种有机试剂及表面活性剂对酶活力的影响存在差异，且不同浓度也存在差异。丙酮、乙醇、尿素、CTAB、吐温80 和SDS 均对重组酶CpAChE 活性有抑制作用，抑制作用随着试剂浓度的提高而增强，而乙醇对重组酶CpAChE 活性抑制作用相对较弱。经对9 种金属离子对重组酶CpAChE 活性的影响分析发现，Mg2+、K+、Ca2+和Li+离子对该酶活性有较强的促进作用，其中Mg2+（5 mmol/L）的促进最为明显，使该酶活力提高约1.7 倍，而Cu2+、Fe3+和Zn2+离子则对该酶表现出较强的抑制作用。

表1 有机溶剂及金属离子对CpAChE 活性的影响Table 1 Effects of various organic solvents and metal ions on the activity of recombinant CpAChE

2.5 重组酶CpAChE 对农药的敏感性测定

重组酶CpAChE 与16 种有机磷和氨基甲酸类农药的敏感性如表2所示，结果表明不同农药对CpAChE 活性抑制存在差异，16 种农药对CpAchE 的IC50由小到大顺序为：克百威<涕灭威<甲拌磷<敌敌畏<仲丁威<久效磷<乐果<毒死蜱<对硫磷<倍硫磷<西维因<马拉硫磷<叶蝉散<残杀威<速灭威<抗蚜威。8 种有机磷农药对CpAchE 的IC50差异较小，而氨基甲酸酯类农药对CpAChE 的IC50差异较大，其中CpAChE 对克百威的敏感性最强，IC50为0.176 μg/mL，而对速灭威和抗蚜威的敏感性很弱，IC50分别为17.0 μg/mL 和182.7 μg/mL。由IC15结果可知，重组酶对上述16 种农药的检查范围为0 至3.0 μg/mL 不等，而对克百威检查最为敏感，综上可以确定重组CpAChE 可以用于多种有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的检测。在一级反应时间之内（10 min），重组CpAChE 的动力学常数Km和Vmax分别为1.639 mg/mL 和8.071 μmol/min/mg。

表2 重组乙酰胆碱酯酶对农药敏感性分析Table 2 Sensitivity and the limit of detection of recombinant CpAChE to pesticides

（续表2）

2.6 乙酰胆碱酯酶与克百威分子对接模型分析

以数据库中的乙酰胆碱酯酶（PDB：1f8u，PDB：2w6c，PDB：2x8b 和PDB：4bdt） 作为模板，利用Discovery studio 2.5 中的MODELER module 模块对CpAChE 进行同源建模，得到的模型经 Ramachandran 图评估，该模型蛋白中的83.0%氨基酸在核心区域为（A，B，L 区），11.7%的氨基酸分布在允许区域（a，b，l，p 区），3.2%的氨基酸分布在额外接受区域（～a，～b，～l，～p 区），仅有2.2%的残基落在不允许区域内（空白区），约98%以上的氨基酸构象合理，表明所构建的氨基酸构型稳定。用Profile-3D 对分子模型中氨基酸序列的相容性进行评价表明，92.7%的氨基酸Verify score 大于0.2，氨基酸残基侧链合理，上述分析表明模型的构建是成功的。

配体克百威和受体胆碱酯酶CpAChE 模型对接，通过CDOCKER ENERGY 打分后，选择最适的结合构象，由图3可知，配体克百威分子进入到了CpAChE 分子的活性口袋[24]。由于配体分子在结合物中的结合构象的不同，从而使得它们形成相互作用的活性位点周围的氨基酸残基以及相互作用强弱均不同。进一步分析发现，重组乙酰胆碱酯酶CpAChE 与底物克百威3Å 范围内的氨基酸共19 个，其中以范德华力发挥作用的氨基酸16个，分别是Asp96、Ile105、Trp108、Asn109、Gly142、Gly143、Gly144、Glu224、Tyr155、Ser225、Ala226、Phe315、Phe356、His495、Gly496 和Ile499，而以氢键作用力发挥作用的氨基酸是Tyr146、Ser147 和Tyr355，是与克百威作用的最为关键的氨基酸。由此可见，二者在结合过程中所产生的范德华力和氢键可使小分子克百威与CpAChE 紧密结合，进而竞争性抑制CpAChE 酶活性。

图3 乙酰胆碱酯酶CpAChE 的分子模型及与克百威结合位点分析Fig.3 Molecular model of the recombinant CpAChE and docking results with carbofuran

3 讨论

自发现乙酰胆碱酯酶（AChE）可用于农药残留的检测之后[25-27]，人们对乙酰胆碱酯酶的挖掘，提高酶的灵敏性和降低生产成本等方面的研究从未停止过。乙酰胆碱酯酶主要来自脊椎动物和非脊椎动物，而大量研究表明不同来源的乙酰胆碱酯酶对农药的敏感性存在较大差异，其中脊椎动物中的鱼类普遍对OPs 和CBs 杀虫剂有较强敏感性[28]。Chuiko[29]通过对来自白鲑科、狗鱼科、鲈科和鲤科类的11 种鱼的AChE 研究发现，鲤科鱼较其它3 类鱼不仅表现出较高的酶活性，同时灵敏性也非常突出。虽然鲤科鱼类的AChE 性质突出，但是由于问题的复杂性及相关技术的不成熟，近十年，鲤鱼来源乙酰胆碱酯酶的研究才进入到分子时代，这与非脊椎动物为代表的果蝇、家蚕和线虫来源的AChE 等研究深度还有一定的差距。

迄今为止，包括昆虫、动物细胞和植物在内的表达系统已成功对AChE 进行了表达，但由于操作的复杂性和较高的生产成本致使其并不适合大规模生产乙酰胆碱酯酶[30-32]。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）系统[33]能够对外源基因产物进行修饰，如糖基化和生成二硫键等，遗传操作简便，仅使用纯试剂进行培养，如甲醇、葡萄糖或甘油、生物素、无机盐和水。此外，巴斯德毕赤酵母细胞可以高密度培养，分泌的内源性蛋白水平低，且在AOX1 启动子控制下高水平表达异源蛋白，使得巴斯德毕赤酵母表达系统广泛被用于真核基因的表达。该系统中的表达载体主要有pPICZα A、pPSC3k 和pPIC9K 等，常用的宿主菌主要有GS115、X-33 和KM71 等，毕赤酵母中不同的表达质粒和宿主的组合差异会对酶的表达量和性质造成显著影响[34]，重组乙酰胆碱酯酶CpAchE 在SDS-PAGE 分析中，目标条带大小与理论大小存在差异，其原因很可能是巴斯德毕赤酵母的内源蛋白酶切割CpAchE 所致。乙酰胆碱酯酶基因CpAChE 中存在多个Kex2 蛋白酶酶切位点（6处），同时CpAChE 中存在6 个潜在的N 糖基化位点未受到宿主的糖基化修饰，使得蛋白的分子质量大小与理论值存在差异，而这与Sato 等[19]研究结果存在差异，表明不同的宿主和载体可对酶的性质造成不同影响。本研究采用pPIC9K 质粒和GS115 宿主对优化后鲤鱼乙酰胆碱酯酶基因CpAChE 进行重组表达，使鲤鱼乙酰胆碱酯酶CpAChE 的表达量提高了40 倍。

CpAChE 对本研究中检测的16 种有机磷和氨基甲酸酯类农药中的14 种表现出一定的敏感性（IC50值均<4 μg/mL）。总体而言，CpAChE 对氨基甲酸酯类农药表现出更强的敏感性，其中对克百威表现出最高的敏感性，这与Dembele 等[35]报道相一致。分子对接分析中发现，克百威分别与受体CpAChE 中的Tyr146、Ser147 和Tyr355 形成氢键，这些氢键网络增强了克百威与CpAchE 的结合能力，因此加强了与底物竞争CpAChE 能力。除此之外，有机小分子和蛋白质等生物大分子之间的疏水作用力和范德华力也发挥重要作用。

本研究利用巴斯德毕赤酵母表达系统对优化的乙酰胆碱酯酶基因进行了高效表达，该酶可用于常见农药残留的检测，其中对克百威的检测最为灵敏，克百威主要通过与重组CpAChE 形成稳定的复合体达到抑制酶活性的效果，而Tyr146、Ser147 和Tyr355 很可能在其中发挥更加重要的作用。