益生菌干酪乳杆菌Zhang对大鼠空间学习记忆能力的影响

王 帅，马 达，张 勇，孙志宏*

分离自传统发酵酸马奶的益生菌干酪乳杆菌Zhang（LCZ），除了在体外具有良好的耐酸性、人工胃肠液耐受性及胆盐耐受性等益生特性外，在动物试验中已被证明具有改善肠道菌群、拮抗致病菌、免疫调节、抗氧化、预防治疗肿瘤等多种有益功能[1-2]。关于LCZ 对机体认知能力的影响却鲜有报道。此外，诸多研究表明肠道与大脑之间的双向交流会影响焦虑、抑郁、认知和社交互动等行为[3-4]。同时，肠道菌群组成的庞大微生物系统寄居于肠道，并与宿主之间存在着共生的关系，使得微生物也参与肠道与大脑之间的双向应答[5-6]。

目前，测试动物模型药物干预后行为学的方法主要有：巴恩斯迷宫、莫里斯水迷宫、条件性恐惧试验、新目标和新方位识别试验、旷场试验及转轮试验等[7-8]。其中，巴恩斯迷宫（Barnes）是美国学者Carol A Barnes 于1979年发明的用于检测动物空间学习记忆能力的模型[9]，利用啮齿类动物喜欢黑暗幽闭环境的天性建立，对动物的应激性刺激较小，不需要食物剥夺和足底电击，也能够一定程度上排除测试中大鼠肢体运动功能障碍对试验的影响，在认知常规测试具有较高的认可度[10-11]。Pardo 等[12]利用Barnes 迷宫评估IGF-I 基因治疗对老年雌性大鼠空间记忆能力的影响，结果发现经IGF-I 基因治疗的大鼠较对照组在Barnes 迷宫中对目标洞口的探查频率高，空间记忆能力强。Savignac 等[13]在研究双歧杆菌对BALB/c 小鼠认知能力的影响时发现，经双歧杆菌干预的小鼠，其在Barnes 迷宫中探索错误洞口的次数较对照组少，空间学习能力强。本研究选择巴恩斯迷宫试验来评估益生菌LCZ 对大鼠的空间学习记忆能力的影响，以期为LCZ 干预对认知能力的影响提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF 级7 周龄SD 健康雄性大鼠（动物许可证号：SCXK（京）2016-0006），北京维通利华实验动物技术有限公司；大小鼠生长维持饲料（大豆多肽占饲料质量比2%），北京华阜康生物科技股份有限公司；益生菌LCZ，内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点试验室；Barnes 迷宫 （型号：XR-XB108），上海欣软信息科技有限公司。

1.2 动物分组及灌胃设计

将20 只大鼠分笼饲养，每笼2 只，每天昼夜循环光照12 h，环境温度20～25 ℃，相对湿度50%～60%。自由进食进水，每天更换饲料和饮水。适应性饲喂1 周后，随机分组，设为对照组（NC 组，n=10）及益生菌LCZ 组（LCZ 组，n=10）。NC 组大鼠在适应性饲喂后的第1 周～第11 周每天灌胃生理盐水1 mL，共10 周；LCZ 组大鼠在适应性饲喂后的第1 周～第11 周每天灌胃含有4×109CFU/mL 的LCZ 活菌液1 mL，共10 周。

1.3 大鼠体重与摄食量的测定

每周称量大鼠体重并记录。两组大鼠于适应后的第1 周起每天早9：00 投放饲料，第2 天早9：00 称量剩余饲料并记录，最后计算出每周每只大鼠的摄食量情况。

1.4 Barnes 迷宫试验测试大鼠的空间学习记忆能力

1.4.1 Barnes 迷宫设备 Barnes 迷宫是利用啮齿类动物避光喜暗的特性而建立的，它由一个圆形平台构成，在平台的周边布满20 个穿透平台的小洞，圆盘直径122 cm，洞口直径10 cm。在其中一个洞的底部连接一个黑暗的躲避盒，被称为目标洞，试验场所四周可以设置视觉参考物，经过训练，动物学习并记忆目标洞的位置。迷宫设置在光线暗的安静房间，测试时可予探照白炽灯照耀其平台上，还可配以规律的噪音以促进大鼠能尽快逃至目标箱。每次训练后都用70%酒精喷洒清洗，转动圆盘变换洞口对应的圆盘位置，但是目标洞的空间置不变，以防止大鼠通过嗅觉线索找到目标洞口，避免对行为学测试结果的干扰。试验时将大鼠置于迷宫中央，在圆盘的顶部采用强光照射（200 W） 刺激试验动物寻找并进入躲避洞口，采用视频跟踪系统软件ANY maze 记录试验动物每次找到目标洞的时间。

1.4.2 Barnes 迷宫试验

1.4.2.1 空间学习能力训练 本研究在大鼠结束10 周灌胃后的第7 天开始采用Barnes 迷宫进行为期4 d 的空间学习能力训练，每天训练2 次，训练开始时将大鼠放置在圆盘中央，开启强光刺激，直到大鼠找到并进入目标洞，立即停止强光刺激，并让其在目标洞中停留30 s，如果大鼠在240 s 内仍然不能找到目标洞，则将其引导至目标洞并让其在目标洞也停留30 s，每次训练测试间隔15 min，记录测试中大鼠到达目标洞的时间 （潜伏期）。

1.4.2.2 短期空间记忆能力的测试 大鼠在空间学习能力训练开始后的第5 天进行一次空间记忆功能的测试，测试大鼠对训练所获得的短期空间记忆能力。测试时，将大鼠放置在圆盘中央，开启强光刺激，直到大鼠找到并进入目标洞，但不让大鼠在目标洞内停留，记录大鼠到达目标洞的时间（潜伏期）与运动轨迹。

1.5 统计学方法

用SPSS 22.0 统计分析软件处理试验数据，对于巴恩斯迷宫试验中空间学习能力训练期的行为学数据，以不同组别和训练天数（重复测量数据）作为方差来源，采用有重复测量数据的双因素方差分析。对于巴恩斯迷宫试验短期空间记忆能力测试以及其它试验的组间比较，采用独立样本t检验比较各组指标的差异显著性，P<0.05 为差异显著，各项指标以平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 大鼠摄食量与体重测定结果

两组大鼠于适应后的第1 周起每天早9：00投放饲料，第2 天早9：00 称量剩余饲料并记录，最后计算出每周每只大鼠的摄食量，结果如图1所示，两组大鼠第1～4 周摄食量均较高，其中NC组大鼠摄食量为 （24.91±0.86）g/只/d，LCZ 组大鼠摄食量为（24.98±0.09）g/只/d。第4～5 周其摄食量均降低，其中NC 组摄食量降低（3.11±0.68）g/只/d，LCZ 组大鼠摄食量降低（2.76±1.43）g/只/d。两组大鼠在第4～9 周之间，摄食量出现波动，其中NC组大鼠在第4～6 周先增加（1.57±0.57）g/只/d，而后在第6～7 周降低（3.23±0.51）g/只/d，此后基本稳定；而LCZ 组大鼠在第5～6 周增加至（23.15±2.01）g/只/d，此后在 第6～8 周下降至（20.44±0.33）g/只/d，第8～9 周又增加为（21.51±3.34）g/只/d。第8～11 周，两组大鼠的摄食量变化趋势一致，均降低。虽然整体来看，LCZ 组大鼠从第3～4 周开始摄食量高于NC 组，但两组大鼠之间并没有显著性差异（P>0.05）。

图1 大鼠第1～11 周的摄食量测定结果Fig.1 The food intake of rats from week 1 to 11

NC 组大鼠与LCZ 组大鼠于适应后的第1 周起分别灌胃生理盐水与4×109CFU/mL 的LCZ 活菌液各1 mL，持续10 周，结果如图2所示，对两组大鼠的体重变化情况进行分析，发现两组大鼠在前4 周的体重增长较快，其中NC 组大鼠的体重由（190.09±11.14）g 增至（366.75±26.65）g，每周体重增长（44.17±5.64）g；LCZ 组大鼠的体重由（193.00±7.72）g 增至（366.10±14.33）g，每周体重增长（43.28±2.45）g。从第5 周开始体重增长趋于平缓，其中NC 组大鼠的体重由（366.75±26.65）g增至（460.83±30.28）g，每周体重增长（13.44±1.39）g；LCZ 组大鼠的体重由（366.10±14.33）g 增至（454.53±24.75）g，每周体重增长（12.63±2.72）g。虽然整个试验周期NC 组大鼠的体重均略高于LCZ组大鼠体重，但两组之间没有显著性差异（P>0.05）。

图2 大鼠第0～11 周的体重测定结果Fig.2 The body weight of rats from week 0 to 11

2.2 Barnes 迷宫行为学测试结果

在空间学习能力训练的过程中，有重复测量数据的双因素方差分析结果显示训练天数对大鼠潜伏期具有显著性影响（图3），与第1 天相比，大鼠第3 天潜伏期缩短显著（P=0.049）（图3），第4天潜伏期缩短极显著（P=0.001）（图3）。两组大鼠在4 d 的空间学习能力训练期间潜伏期均逐渐缩短，NC 组大鼠虽然在第3 天出现延长，但随后再次缩短，差异并不显著（图3）。两组大鼠第1 天的潜伏期几乎一致，其中NC 组大鼠的潜伏期为（212.61±34.92）s，LCZ 组大鼠为（207.59±42.38）s。从第2 天开始两组大鼠潜伏期明显缩短，其中NC组大鼠的潜伏期比第1 天缩短 （25±86.31）s，为（187.61±75.73）s，而LCZ 组大鼠的潜伏期为（139.99±74.98）s，比第1 天缩短（67.6±51.71）s。之后，两组出现显著差异，第3 天，LCZ 组大鼠的潜伏期（115.10±87.38）s，比NC 组显著缩短（95.63 s±86.78 s，P<0.05）。NC 组大鼠第4 天的潜伏期较第3 天缩 短（38.53±90.82）s，为（172.20±84.65）s，而LCZ 组大鼠为 （87.80±63.18）s，显著短于NC 组（P<0.05）。结果表明，益生菌LCZ 可显著改善大鼠空间学习能力。

图3 大鼠Barnes 迷宫空间学习能力训练结果Fig.3 The spatial learning of rats in Barnes maze

在短期空间记忆的测试中（空间学习能力训练后的第1 天） 独立样本t 检验分析结果显示LCZ 组大鼠潜伏期为（93.65±71.88）s 显著短于NC组（174.42 s±77.51 s，P<0.05）（图4a）。空间学习能力训练后的第1 天，如图4b 所示，图中蓝色圆形表示迷宫圆形平台，中央红色实心点表示大鼠起始位置，红色圆形表示目标箱位置，绿色线条表示大鼠运动轨迹，由图可知，NC 组大鼠轨迹分布杂乱，很难找到目标洞口，而LCZ 组大鼠轨迹分布更清晰，目标更明确，能够较迅速找到目标洞口并进入。结果表明，益生菌LCZ 可显著改善大鼠短期空间记忆能力。

图4 大鼠Barnes 迷宫短期空间记忆测试结果Fig.4 The short-term spatial memory of rats in Barnes maze

3 讨论

本研究为探讨益生菌LCZ 对大鼠的认知能力的影响，以LCZ 为研究对象，基于LCZ 组每只大鼠摄入4×109CFU/d 的活菌液剂量进行10 周的大鼠饲喂试验与5 d 的Barnes 迷宫试验。

体重是反映生物体健康状况的一项重要指标，与摄食量保持精确的能量代谢动态平衡。本研究中，试验期间两组大鼠的体重虽无显著性差异但呈逐渐增长的趋势。其中两组大鼠第1～4 周的摄食量较多，第0～4 周的体重增长较快，此阶段大鼠为6～10 周龄，属青春期[14]。两组大鼠第5～11 周的摄食量较少，第5～11 周体重增长较缓且逐渐趋于稳定，此阶段大鼠为11 周龄以上，属成年期[14]。

本研究首先提出了利用益生菌LCZ 干预大鼠来研究其对大鼠空间学习记忆能力的影响。在Barnes 迷宫试验中，LCZ 组大鼠在训练期间潜伏期显著短于NC 组大鼠，其空间学习能力更强，与Savignac 等[13]报道中，经长双歧杆菌或短双歧杆菌干预的BALB/c 小鼠在Barnes 迷宫训练期间的潜伏期均低于对照组大鼠的结果相近，值得一提的是本研究结果具有显著性差异；LCZ 组大鼠在测试期间潜伏期显著短于NC 组大鼠，其短期空间记忆能力更强，与赵宁军[15]发现缺血并给予Boc-D-CMK 治疗组的大鼠定位到目标逃离暗箱的时间明显短于缺血组大鼠的结果相一致。以上结果表明，益生菌LCZ 可以显著改善大鼠空间学习记忆能力。

肠道菌群参与了宿主的营养、免疫、代谢甚至神经发育等多个过程，认为是宿主的第二套基因组[16]。益生菌作为肠道菌群中的一员，被证明具有调节肠道菌群结构的功能。LCZ 干预对肠道菌群多样性有着重要的影响。Zhang 等[17]通过小规模人群试验评价了LCZ 对不同年龄人群肠道微生物群落的影响，结果发现LCZ 干预显著增加了有益菌如双歧杆菌、短链脂肪酸产生菌和抗炎症细菌的丰度。LCZ 与肠道中考拉杆菌的数量呈负相关的关系，同时下调了条件致病菌梭菌、沙雷氏菌、肠球菌和志贺氏菌的丰度。这说明LCZ 干预对肠道菌群多样性有着重要的影响。

近年来，诸多研究表明肠道微生物可以调节宿主的认知能力，其主要通过调控迷走神经、免疫因子和下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）进而调节中枢神经系统改变宿主的认知和行为[18]。迷走神经由大约80%的传入神经构成，主要收集从食道到结肠的感觉信号，将之传入到中枢。Goehler 等[19]利用空肠弯曲杆菌引入雄性CF1 小鼠胃肠道，并在4～12 h 后通过免疫组织化学评估迷走感觉神经元和大脑中神经元激活标记c-Fos 的表达发现，空肠弯曲杆菌的干预导致迷走神经节两侧神经元的c-Fos 表达显著增加，小鼠表现出了明显的焦虑行为，而循环中的促炎细胞因子水平却没有升高，表明在这个阶段机体主要的免疫反应未启动，从而证明该现象不是由细胞因子介导的。而在慢性细菌感染的试验中，Bercik 等[20]使用幽门螺杆菌慢性感染BALB/c 小鼠，发现可导致该小鼠胃排空延迟及内脏敏感性下降，从而出现异常摄食行为，该异常摄食行为伴有血浆生长素释放肽和餐后肌酸激酶升高、肿瘤坏死因子α（正中隆起）升高和POMC（弓状核）mRNA 降低，表现为进食次数增多而进食量少，其进食模式的机制可能与弓状核POMC的下调和下丘脑正中突起的前炎症因子的表达增多有关。HPA 轴也是肠道菌群影响中枢的重要途径。Sudo 等[21]利用无菌小鼠首次探究了肠道菌群和中枢神经系统的相关性，其结果表明无菌小鼠的HPA 应激反应较SPF 级小鼠明显增强，无菌小鼠的血浆促肾上腺皮质激素和皮质酮在抑制应激反应中也显著升高。随后经婴儿双歧杆菌干预的无菌小鼠，其HPA 应激反应与干预前相比明显减弱。相比之下，经肠致病性大肠杆菌干预的无菌小鼠，其HPA 应激反应与干预前相比明显增强。这表明，肠道菌群可以影响小鼠HPA 应激反应。因此，本研究中LCZ 组大鼠的空间学习能力与短期空间记忆能力得到显著改善，可能是益生菌LCZ通过增加微生物的多样性和益生菌丰度改善肠道菌群进而调节迷走神经或免疫因子或下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）从而调控中枢神经系统改善大鼠空间学习记忆能力。

本研究中，NC 组大鼠在训练期的第3 天潜伏期出现延长随后又在第4 天缩短，与Mchail 等[22]利用Barnes 迷宫探究幼年大鼠空间导航能力的研究中，大鼠在训练期间潜伏期出现波动的结果相近，这可能是大鼠个体差异导致。

4 结论

本研究首先提出了利用益生菌LCZ 干预大鼠来研究其对大鼠空间学习记忆能力的影响。通过评估大鼠在Barnes 迷宫中的潜伏期，证实了益生菌LCZ 对大鼠空间学习记忆能力具有显著的改善作用。通过研究益生菌LCZ 对大鼠空间学习记忆能力的影响，为益生菌干预对认知能力的影响的方法提供一定的理论依据。