姬松茸提取物的降血糖作用及对糖尿病大鼠肠道菌群的影响

魏 奇，钟鑫荣，陈炳智，江玉姬*

糖尿病是由多基因和环境等因素综合作用引起的，以高血糖为特征的内分泌代谢疾病[1]。糖尿病引起的高血糖症状主要是由于机体胰岛素产生抵抗作用，因此机体对胰岛素的敏感性下降，从而导致血液中胰岛的利用受阻，无法发挥其降血糖作用。如果长期处于高血糖状态，就会导致机体内部各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管及神经系统的慢性损害和功能障碍[2-3]。虽然目前临床上有大量的西药能在短期内有效控制血糖，但是其毒副作用大，无法防止糖尿病慢性并发症的危害。鉴于此，开发具有毒副作用小、疗效稳定等特点的天然降血糖活性物质引起人们的高度关注[4]。

姬松茸（Agaricus blazei Murrill）作为食药用菌，味道鲜美，营养丰富，有着很高的药用价值。如其具有提高免疫力、抑制肿瘤和强化化疗药物的治疗等作用[5]。本研究建立糖尿病大鼠模型，研究姬松茸提取物对糖尿病大鼠的降血糖作用和对肠道菌群的影响，为进一步研究其作用机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、实验动物与试剂

姬松茸：福建古田盛耳食品有限公司。

实验动物：雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，8周龄，体重（200±20）g，由南京军区福州总医院提供。

试剂：水合氯醛、链脲佐菌素（STZ），美国Sigma 公司；苏木素伊红染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；TIANamp Soil DNA kit 抽提试剂盒，田根生化科技（北京） 有限公司；QIAquick Gel Extraction Kit，德国QIAGEN 公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙醇、吐温-80、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、生理盐水等试剂，购于国药集团化学试剂有限公司，纯度为分析纯。

1.2 仪器与设备

HGM-114 血糖仪、AS1 血糖测试纸，欧姆龙自动化有限公司；SpectraMax i3X 多功能酶标仪，美国Molecular Devices 公司；StepOne 型荧光定量PCR 仪，美国Thermo 公司；DYY-6C 型稳压稳流电泳仪，北京六一仪器厂；PCR 反应扩增仪，美国Bio-Rad 公司；HiSeq 测序仪，美国Illumina 公司；Heraeus Megafuge 8R 台式离心机，美国Thermo公司。

1.3 试验方法

1.3.1 姬松茸提取物的制备 姬松茸干制品放入60 ℃鼓风干燥箱烘干2 h，粉碎过80 目筛，称取1 kg 姬松茸粉末，放入中药多功能提取罐中进行热回流提取，无水乙醇浸提3 次，每次3 h，提取温度70 ℃，提取剂体积50 L。真空抽滤处理，去除提取液残渣。在温度45 ℃条件下，将乙醇旋转蒸发至干即得姬松茸乙醇提取物（EE）。取一部分乙醇提取物用水溶解，再用乙酸乙酯萃取3 次（料液比1∶3，时间2 h），合并有机相，在温度45 ℃条件下，将乙酸乙酯旋转蒸发至干即得姬松茸乙酸乙酯提取物（EA）。

1.3.2 糖尿病大鼠的建立 健康SD 大鼠购入后，基础饲料喂养，自由饮水，每笼4 只，在温度（23±2）℃、湿度（50±10）%以及12 h 明暗循环（光照8：00-20：00）的条件下适应性喂养1 周。1 周后全部大鼠禁食（不禁水）12 h。正常组大鼠给予腹腔注射柠檬酸缓冲液，剩余大鼠腹腔注射STZ 溶液（STZ 溶液用柠檬酸缓冲溶液配制），剂量为55 mg/kg。注射3 d 后，大鼠禁食（不禁水）12 h，测定空腹血糖值和体重，空腹血糖值高于11.1 mmol/L即认为是糖尿病大鼠。

1.3.3 分组及给药 本试验所使用的SD 大鼠总共42 只，包括36 只糖尿病鼠和6 只正常大鼠。36只情况良好的糖尿病大鼠，根据血糖和体重随机分为6 组，每组6 只，正常组由6 只正常大鼠组成。正常对照组（N）和模型对照组（M）灌胃生理盐水，阳性对照组灌胃格列镁脲（P）0.1 mg/kg，高、低剂量组分别按500，250 mg/kg 灌胃姬松茸乙醇提取物（EH 和EL）和姬松茸乙酸乙酯提取物（AH 和AL）。所有试验操作遵循Specific Pathogen Free动物饲养房的饲养规程，每天给大鼠更换干净的垫料。每天9：00 灌胃一次，连续28 d。所有大鼠，正常喂食、喂水。次日测血糖值时，则前1 天需要禁食（不禁水）。

1.3.4 大鼠一般特征的观察 观察试验过程中大鼠的精神活动状况、毛发改变情况、进食量、饮水量、排尿量以及排便量，并记录大鼠体重的变化情况。体重：试验期间，记录第0、7、14、21 天和28 天大鼠体重。从而计算给药体积，同时可以进行比较各组间体重的差异。

1.3.5 空腹血糖检测 空腹血糖：各组大鼠在第0 天和28 天禁食12 h（不禁水），于次日上午9：00进行血糖检测。采用尾尖取血的方式，用欧姆龙血糖仪进行检测。

1.3.6 肝脏组织HE 染色 取大鼠肝脏组织用4%多聚甲醛固定48 h 后，经透明、浸蜡、包埋、切片处理，切片的厚度约为4 μm。用苏木素染色5 min，水洗3～5 s，伊红染液染色2 min，水洗后滴加中性树胶进行封片，自然晾干，用显微镜观察组织变化，拍照记录。

1.3.7 肠道菌群的检测 提取盲肠内粪便样本的DNA，以稀释后的基因组DNA 为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode 的特异引物，New England Biolabs 公司的Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 和高效高保真酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit 和q-PCR 定量。文库合格后，使用HiSeq 2500 PE 250进行测序。

1.3.8 统计学分析 所得数据采用SPSS 18.0 软件对试验结果进行统计分析（ANOVA），利用邓肯式多重比较对差异显著性进行比较分析，P<0.05为具有统计学显著意义。

2 结果与分析

2.1 姬松茸提取物对糖尿病大鼠一般体征的影响

为了研究姬松茸提取物对糖尿病大鼠的影响，采用STZ 诱导SD 大鼠建立糖尿病的大鼠模型评估姬松茸提取物的降血糖活性。N 组的大鼠毛发纯白有光泽，活动频繁，精神状态良好，鼠笼垫料干燥；M 组的大鼠毛发稀落枯黄、粗糙欠光泽，竖毛弓背，精神萎靡，尾巴湿冷，垫料潮湿。由此可以看出糖尿病大鼠外观形态发生改变。如图1a 所示，N 组的大鼠体重在试验过程中逐步增加，造模成功后的糖尿病大鼠体重急剧下降。从图1b、c、d 可知，糖尿病大鼠的食物摄入量（52 g±3 g）、排尿量（281 mL±48 mL）和排便量（22 g±2 g）与正常组食物摄入量（26 g±1 g）、排尿量（14 mL±6 mL）和排便量（8 g±3 g）相比显著增加（P<0.05）。糖尿病大鼠出现多饮、多尿、多食且消瘦典型的糖尿病症状。给予姬松茸提取物或格列美脲后，STZ 诱导的糖尿病大鼠的体重无明显增加，但是大鼠的毛发变得更加润泽，活动增多，排尿量有所缓解，精神状态有所改善，“三多一少”的症状有所减轻，说明姬松茸提取物能够在一定程度上改善糖尿病大鼠的生活状态。

图1 姬松茸提取物对大鼠状态的影响Fig.1 Effects of Agaricus blazei Murrill extracts on rats related parameters

2.2 姬松茸提取物对糖尿病大鼠空腹血糖的影响

空腹血糖值作为糖尿病最常规的检测指标，能够反映糖代谢是否紊乱及胰岛β 细胞功能是否良好。如图2a 可知，第0 天时，M 组和姬松茸提取物给药组在空腹血糖指标上无显著差异（P>0.05）。与N 组相比，M 组大鼠的空腹血糖值显著增加（P<0.05），此时糖尿病大鼠的空腹血糖值大于11.1 mmol/L，表明造模成功。给药后第28 天（图2b），EH 组和EL 组的空腹血糖值分别为（24.6±1.5）mmol/L 与（22.6±4.1）mmol/L，与M 组的空腹血糖值（26.2±4.1）mmol/L 相比有所减少，但在统计学上没有差异（P>0.05）。AH 组和AL 组的空腹血糖值分别为（17.0±4.8） mmol/L 和（17.3±2.8）mmol/L，与M 组的空腹血糖值（26.2±4.1）mmol/L相比，下降了9.2 mmol/L，差异显著（P<0.05），表明EA 具有明显的降糖效果。由此说明EA 体内降血糖作用比EE 好，并且不同剂量的EA（AH 组和AL 组）对糖尿病大鼠都有显著的降低空腹血糖值作用（P<0.05）。

图2 姬松茸提取物对大鼠空腹血糖水平的影响Fig.2 Effects of Agaricus blazei Murrill extracts on fasting blood glucose levels in rats

2.3 姬松茸提取物对糖尿病大鼠肝脏组织病理学形态的影响

肝脏组织HE 染色结果如图3所示，N 组的大鼠肝小叶规则，肝细胞形态正常，胞核居中且清晰可见，索状排列整齐，呈放射状分布。M 组的大鼠肝索单层排列紊乱，肝细胞明显肿大，胞质淡染呈现疏松颗粒状并有空亮区，中央静脉旁可见巨噬细胞，肝细胞出现炎症。相比之下，经姬松茸提取物干预后，糖尿病大鼠肝脏细胞肿胀部分得到恢复，坏死及炎症细胞减少，炎症症状有所减轻，说明姬松茸提取物对糖尿病大鼠肝脏组织具有保护和修复作用。

图3 肝脏组织HE 染色（×200）Fig.3 HE staining of the liver in rats（×200）

2.4 姬松茸提取物对糖尿病大鼠肠道菌群的影响

2.4.1 大鼠肠道菌群多样性分析 各组样品的相关多样性指数见表1。如表1所示，模型组的肠道菌群OUT、ACE、Chao、Shanon 指数低于正常组，由此说明经STZ 诱导的糖尿病大鼠的肠道菌群多样性降低，肠道菌群丰度下降。与M 组相比，姬松茸提取物能够提高ACE、Chao 和Shannon 指数。由此可知，姬松茸提取物能够增加糖尿病大鼠肠道菌群的多样性。

表1 大鼠肠道菌群的丰度和α 多样性Table 1 Abundance and α diversity of gut microbiota in rats

2.4.2 大鼠肠道微生物种群的结构分析 如图4显示了各组样品肠道菌群在门水平上相对丰度的情况。如图4a 所示，在门水平上，各组肠道菌群主要细菌为：厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、螺旋体门（Spirochaetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和柔膜菌门（Tenericutes）。厚壁菌门和拟杆菌门在糖尿病大鼠和健康大鼠中均为主要优势菌种。由图4b 可知，模型组中厚壁菌门和拟杆菌门所占比例较大，分别为57%和24%。与正常组相比，模型组拟杆菌门的丰富度显著增加（P<0.05）。与M 组相比，EL组大鼠的盲肠内容物样品中拟杆菌门相对丰度显著增加（P<0.05），厚壁菌门相对丰度变化不显著（P>0.05）；EH 组大鼠的盲肠内容物样品中肠道菌群相对丰度变化不明显；AH 组大鼠的盲肠内容物样品中拟杆菌门相对丰度显著增加，厚壁菌门相对丰度减少（P<0.05）。

图4 姬松茸提取物对大鼠肠道菌群的影响Fig.4 Effects of Agaricus blazei Murrill extracts on relative abundance of gut microbiota in rats

2.4.3 大鼠肠道微生物群聚类分析 根据各组样品的丰度信息，其肠道菌群在门水平的热图检测结果如图5所示。由图5可知，各组显著富集的菌群结构存在比较大的差异。与N 组相比，M 组的梭杆菌门和广古菌门丰度上调；与M 组相比，AH，AL，EH 和EL 组梭杆菌门和广古菌门丰度下调，由此推测姬松茸提取物对梭杆菌门和广古菌门丰度的影响较大。与M 组相比，AH 组能够上调黏胶球形菌门（Lentisphaerae）和互养菌门（Synergistetes）丰度；EH 组能够上调蓝藻细菌门（Cyanobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）丰度。

图5 样品在门水平上的热图Fig.5 Heatmap of samples at phylum level

3 讨论

糖尿病是常见的代谢疾病，糖尿病因高患病率和高死亡率成为危害人体健康的主要疾病[6-7]。姬松茸在降血糖方面表现出良好的效果，段县平等[8]报道了姬松茸多糖能够降低糖尿病小鼠的血糖值。Oh 等[9]研究发现姬松茸发酵液的乙酸乙酯提取物主要活性成分为类黄酮（染料木素、染料木苷和大豆黄素），能够有效降低STZ 诱导的雄性SD 大鼠血液葡萄糖含量，增加血清胰岛素含量和GLUT4 蛋白的含量，从而达到降低血糖的作用。Hsu 等[10]发现，姬松茸与二甲双胍和格列齐特降糖药复合使用12 周后，可以降低糖尿病机体的胰岛素抵抗作用。本试验发现灌胃姬松茸提取物可以降低糖尿病大鼠的血糖值，这与李龙[11]的研究结果基本一致。他们用姬松茸粉末制成小鼠饲料喂养8 周可以降低糖尿病小鼠的空腹血糖值，改善糖尿病小鼠的糖代谢。结果表明，姬松茸提取物具有降血糖作用。

本研究发现经STZ 诱导的糖尿病大鼠中观察到厚壁菌门丰度增加，变形菌门丰度减小，说明STZ 诱导的糖尿病大鼠会引起肠道菌群在门水平上发生紊乱，肠道菌群的结构发生变化。该研究结果与Backhed 等[12]的研究结果一致，糖尿病能够导致肠道菌群在门水平上发生变化，增加厚壁菌门的数量。Matsuzaki 等[13]研究发现干酪乳杆菌干预糖尿病小鼠可以降低糖尿病小鼠的血糖值，修复胰岛细胞功能。Tabuchi 等[14]利用鼠李糖乳杆菌干预糖尿病大鼠2 个月，能够促进糖尿病大鼠胰岛素的分泌，降低糖化血红蛋白水平和改善葡萄糖耐受症状。Vrieze 等[15]研究发现，从健康者体内转移粪便给胰岛素抵抗代谢综合征患者后，可以提高胰岛素抵抗代谢综合征患者的胰岛素敏感性，以上研究结果充分提示肠道菌群对改善糖尿病患者胰岛素抵抗和血糖水平具有积极作用。

综上所述，姬松茸提取物能够有效降低糖尿病大鼠的血糖值，保护和修复糖尿病大鼠肝脏组织。与模型组相比，姬松茸提取物能增加肠道菌群的多样性，改善肠道菌群的结构。通过肠道菌群与糖尿病关系的研究有望为早期预防、控制和治疗糖尿病提供新的理论依据和治疗途径。