玫瑰枸杞发酵饮品对大鼠耳廓微循环的改善作用

李 雍，秦 勇，刘 伟，周雅琳，李睿珺，于兰兰，陈宇涵，林 峰，许雅君，4*

微循环作为血液循环的最小功能单位，肩负着为体内活细胞提供营养物质并移除代谢副产物的使命，是机体物质能量交换的基本场所，也是心血管系统在组织内真正发挥功能的部位[1-2]。微循环障碍是微循环管道、血流及其功能发生紊乱的总称，几乎与各系统的多种急、慢性疾病均有着密切关系[3]。基于其重要性，微循环学已成为一门热点研究课题。中医学中的“孙络”与现代医学的微血管，特别是微循环在解剖形态学及自身循环特点上具有密切相关性[4]，“孙络”运气行血，而气血在经络中流动时易受干扰，当络失通畅或渗灌失常时则常会导致瘀血阻络等基本病理变化[5]。微循环障碍与血瘀证有着紧密的联系，目前临床上常运用活血化瘀的药物，通过改善微循环等途径达到活血通络化瘀的功效。

中药重瓣红玫瑰性微温、味甘微苦，归肝、脾、胃经，在我国有着2 000 多年栽培历史，广泛用于中医处方配药，具有行气活血，开窍化淤，疏肝醒脾之功效[6-7]。《本草正义》[8]记载：“疏气活血，宣通窒滞而绝无辛温干燥之弊，断无其匹”。目前科学研究也发现玫瑰具有促进血液循环，强化血管壁弹性等功效[9]。枸杞成熟干燥果实称枸杞子[10]，枸杞子味甘性平，归肝、肾经，滋肝补肾、益精补血[11]，作为经典方剂的主要组方药物在《中华人民共和国药典》（《中国药典》）2015年版中收录制剂70 余种，有“主五内邪气，热中消渴，周痹”之效[12]。

目前有针对玫瑰花和枸杞子进行改善微循环功效的探索，而未对其二者在改善微循环方面的共同功效进行探究。本试验中玫瑰枸杞发酵饮品以重瓣红玫瑰和枸杞子匀浆经肠膜明串株菌肠膜亚种发酵所得，关于该发酵饮品对于微循环的改善作用研究尚未开展。为了解其功效，本研究采用尾静脉给药的试验方法，通过观测正常用药及高分子右旋糖酐造成急性微循环障碍模型下不同时间点大鼠耳廓微循环血流灌注量（Perfusion Unit，PU）的变化，探讨其改善微循环的作用机制，以期为开发改善微循环的野生植物资源提供一定的试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

重瓣红玫瑰药材：于2015年5月下旬购自亳州市华云中药饮片有限公司，经北京中医药大学张媛副教授鉴定为蔷薇科植物重瓣红玫瑰（Rose rugosa cv.Plena） 的干燥花蕾；枸杞子药材：于2015年5月下旬购自亳州市华云中药饮片有限公司，经北京中医药大学张媛副教授鉴定为茄科植物宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）的干燥成熟果实；高分子右旋糖酐，上海源叶生物科技有限公司；异氟烷，北京科业兴诚科技有限公司；SPF 级健康Sprague Dawlay 雌性大鼠，体重约200～220 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，动物饲养于屏障环境中，实验动物使用许可证号：SCXX（京）2016-0010。

激光多普勒血流检测仪，北京吉安得尔科技有限公司；动物麻醉机，美国Matrx 公司；奥豪斯电子分析天平，上海国际贸易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玫瑰枸杞发酵饮品制备 取重瓣玫瑰花、玫瑰茄药材粉末各10 g，精密称定，加入300 mL水混合搅拌均匀后加入一定量NaHCO3调节pH值至4.5～5.0。在混合液中添加2 g 纤维素酶（20 000 U/g）、2 g 果胶酶（30 000 U/g），50 ℃下酶解90 min，继续加入一定量NaHCO3等调节pH值至5.8～6.0，然后加入10 g 蛋白胨、50 g 白砂糖，混合搅拌均匀。使溶液在90 ℃水浴条件下灭菌30 min，待温度降至室温，接种肠膜明串株菌肠膜亚种发酵（培养温度25 ℃，发酵20 d），发酵结束后，溶液以0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得玫瑰枸杞发酵饮品。

1.2.2 动物分组 40 只雌性大鼠于屏障环境下喂饲维持饲料，饲养环境温度（23±2）℃，湿度50%～60%，光/暗周期12 h/12 h（光照时间7：00-19：00）。经适应性喂养7 d 后，所有大鼠称重，按体重随机分为4 组，分别为空白对照组、玫瑰枸杞发酵饮品低剂量组、中剂量组和高剂量组，空白对照组和不同剂量组每组各10 只。各组均给予维持饲料，自由进食、饮用无菌去离子水。

1.2.3 造模及给药 试验期间每天早上8：00-10：00 对各剂量组进行灌胃，对各剂量组灌胃给药不同剂量的受试样品，其中低剂量组：4 mL/kg、中剂量组：8 mL/kg、高剂量组：16 mL/kg，对照组给予去离子水。以灌胃容量0.1 mL/10 g 连续灌胃30 d，并根据体重来调整灌胃剂量，灌胃期间自由取食和饮水。试验时间30 d，间隔5 d 称重并记录其体重与摄食量。

1.2.4 试验指标检测

1.2.4.1 正常情况下大鼠耳廓微循环测定 分别在灌胃14 d 和30 d 早晨8：00-10：00 测定正常情况下大鼠耳廓微循环情况，试验当天利用实验动物麻醉机，使大鼠吸入异氟烷麻醉，将大鼠腹部向下固定在观察台上，使耳廓平展将激光多普勒血流仪的表面探头固定于耳廓面，记录大鼠耳廓PU值。比较各组大鼠给药14 d 和30 d 前后耳廓微循环PU 差值及血流速度的差异，实验室温度维持在（27±1）℃。

1.2.4.2 高分子右旋糖酐所致耳廓微循环障碍模型测定 在连续灌胃给药30 d 后对大鼠进行高分子右旋糖酐耳廓微循环障碍造模。试验前用温水清洗大鼠鼠尾，并用无水乙醇擦拭大鼠尾部，之后利用实验动物麻醉机使大鼠吸入异氟烷对其进行麻醉，连接多普勒激光血流检测仪并记录尾静脉注射高分子右旋糖酐前大鼠耳廓微循环PU值。测完后立即尾静脉注射10%的高分子右旋糖酐10 mL/kg 以制备微循环障碍模型，15 min 后观察PU 值的变化，以确定造模是否成功。PU 测定后各组大鼠立即按试验剂量灌胃给予发酵饮品或去离子水，1 h 后再次将大鼠麻醉，依照上述同样方法观察记录灌胃后大鼠耳廓微循环PU 值。在第1次PU 测定时利用黑色马克笔在大鼠测量部位的耳朵上画圈标记需要测定的位置，以保证3 次测量的位点一致。比较各组鼠尾静脉注射高分子右旋糖酐前后及灌胃给药后大鼠耳廓微循环PU 值差异，实验室温度维持在（27±1）℃。

1.3 统计分析

2 试验结果

2.1 试验期间动物体重增长

试验期间动物体重变化如图1所示，适应性喂养后，各组动物的初始体重无明显差异（P>0.05）。整个试验期间，各组动物的平均体重均呈现随周龄增加而逐渐增加的趋势。

图1 玫瑰枸杞发酵饮品对大鼠体重的影响Fig.1 The effect of the fermented beverage on the weight of rats

2.2 试验期间动物食物利用率

试验期间各组动物的摄食量如图2所示，各组动物的食物利用率未见明显差异（P>0.05）。

图2 玫瑰枸杞发酵饮品对大鼠食物利用率的影响Fig.2 The effect of the fermented beverage on the food utilization rate of rats

2.3 玫瑰枸杞发酵饮品对正常情况下大鼠耳廓微循环PU 值的影响

如表1结果显示，与空白对照组相比，在干预14 d 后低、中、高3 个剂量组大鼠耳廓微循环PU值均有显著增加，且呈现一定的剂量-反应关系，差异有统计学意义（P<0.05）；在干预30 d 后低、中、高3 个剂量组大鼠耳廓微循环PU 值较空白对照组同样表现为显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；提示玫瑰枸杞发酵饮品能够提升正常大鼠局部微循环的血流灌注量。

表1 玫瑰枸杞发酵饮品对正常大鼠耳廓微循环PU 值的影响（±s，n=10）Table 1 The effect of the fermented beverage on the PU of auricle microcirculation in normal rats（±s，n=10）

表1 玫瑰枸杞发酵饮品对正常大鼠耳廓微循环PU 值的影响（±s，n=10）Table 1 The effect of the fermented beverage on the PU of auricle microcirculation in normal rats（±s，n=10）

注：与空白对照组相比差异有统计学意义，*P<0.05，**P<0.01。

组别 给药14 d 后PU 值 给药30 d 后PU 值空白对照组 264.32±71.19 253.26±90.42玫瑰枸杞发酵饮品低剂量组 324.08±80.77* 318.13±60.10*玫瑰枸杞发酵饮品中剂量组 325.06±30.80* 372.96±53.09**玫瑰枸杞发酵饮品高剂量组 385.28±45.49** 391.90±30.90**

利用独立样本t 检验分析玫瑰枸杞发酵饮品干预14 d 和30 d 对应各组PU 数据差异无统计学意义（P>0.05）。提示正常情况下，服用饮品14 d 后即可达到相对稳定的改善血流灌注量的效果。

2.4 玫瑰枸杞发酵饮品对微循环障碍模型大鼠耳廓微循环PU 值的影响

表2的结果显示，鼠尾静脉注射高分子右旋糖酐后，各组大鼠耳廓PU 值与注射前相比均显著降低（P<0.05），提示高分子右旋糖酐造成的大鼠耳廓局部微循环血流灌流障碍模型建立成功。造模成功后各剂量组按照试验剂量灌胃玫瑰枸杞发酵饮品1 次，1 h 后再次测定大鼠耳廓微循环PU 值，根据表2可判断，灌胃后1 h，高剂量组PU值相比空白组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。中、低剂量组1 h 后的PU 绝对值较造模15 min 时的PU 绝对值也有非常明显的增加，但是标准差较大，未出现统计学上的显著性差异。

表2 玫瑰枸杞发酵饮品对微循环障碍大鼠耳廓微循环PU 值的影响（±s，n=10）Table 2 The effect of the fermented beverage on the PU of auricle microcirculation in microcirculatory disturbance rats（±s，n=10）

表2 玫瑰枸杞发酵饮品对微循环障碍大鼠耳廓微循环PU 值的影响（±s，n=10）Table 2 The effect of the fermented beverage on the PU of auricle microcirculation in microcirculatory disturbance rats（±s，n=10）

注：与空白对照组相比差异有统计学意义，*P<0.05，**P<0.01；与注射高分子右旋糖酐前PU 值相比差异有统计学意义，#P<0.05，##P<0.01。

组别 给药前PU 值 注射后15 min PU 值 给药后1 h PU 值空白对照组 274.98±88.00 160.05±62.53## 221.60±81.08玫瑰枸杞发酵饮品低剂量组 310.36±61.77 201.01±69.89# 251.59±74.39玫瑰枸杞发酵饮品中剂量组 372.96±53.09** 193.43±75.41## 280.25±90.79玫瑰枸杞发酵饮品高剂量组 391.90±30.90** 206.43±49.83## 302.81±46.00*?

分析在建立局部微循环障碍模型基础上，追加给予1 次玫瑰枸杞发酵饮品干预前后PU 差值（表3）可发现，与空白对照组比较，追加干预1 h后中、高剂量组SD 大鼠耳廓局部PU 差值明显升高（P<0.05）；提示玫瑰枸杞发酵饮品可显著提升高分子右旋糖酐所致微血管收缩反应的回复速度，快速改善高分子右旋糖酐造成的微循环障碍。

表3 玫瑰枸杞发酵饮品对微循环障碍大鼠耳廓微循环PU 差值的影响（±s，n=10）Table 3 The effect of the fermented beverage on the difference of PU of auricle microcirculation in microcirculatory disturbance rats（±s，n=10）

表3 玫瑰枸杞发酵饮品对微循环障碍大鼠耳廓微循环PU 差值的影响（±s，n=10）Table 3 The effect of the fermented beverage on the difference of PU of auricle microcirculation in microcirculatory disturbance rats（±s，n=10）

注：与空白对照组相比差异有统计学意义，*P<0.05，**P<0.01。

组别 PU 差值空白对照组 41.78±17.57玫瑰枸杞发酵饮品低剂量组 75.03±49.83玫瑰枸杞发酵饮品中剂量组 86.82±38.44*玫瑰枸杞发酵饮品高剂量组 91.77±22.27**

3 讨论

耳廓微循环变化作为全身微循环的表现具有一定的代表意义，大鼠耳廓背部皮肤纤薄，微血管位置表浅，呈平面分布且充分展开，自细动静脉到毛细血管形成完整的终末血管网络，微血管形态清晰，易于观察便于对各微血管节段进行无创伤性追踪观察[13]。本试验以正常情况下和高分子右旋糖酐造成急性微循环障碍模型下大鼠耳廓微循环血液灌流量的变化为研究指标，探究玫瑰枸杞发酵饮品对大鼠耳廓微循环的改善情况，研究结果表明，正常情况下玫瑰枸杞发酵饮品高、中、低各剂量组均可在灌胃14 d 时显著提升大鼠微循环血流灌注量，并长效稳定保持其提升血流灌注量的功能直至30 d。静脉注射高分子右旋糖酐后，大鼠耳廓血流灌注量显著降低，造成局部微循环障碍模型。给予发酵饮品后，高、中、低剂量组血流灌注量均有显著增加，且与造模前相比较差异均有统计学意义。

微循环是指机体内微细血管与其周围组织细胞进行物质代谢的一系列结构与成分，是全身血液循环的重要组成部分，对各组织脏器血供及功能代谢起着重要作用[14]。微循环负责协调血管张力的调整，以使局部组织灌注与需氧量相匹配[2]。正常情况下，微循环的血流量与组织器官的代谢水平相适应，保证各组织器官的血液灌流量并调节回心血量[15]。正常情况下经口灌胃该饮品14 d时，即可显著提升大鼠微循环并稳定保持，提示该饮品可作为保健品用于改善非病理状态下的微循环情况，对于微循环障碍有一定的预防作用，并可以稳定保持其功效。

微循环可以成为许多病理过程和疾病的原发性或继发性的应答器官，并将直接影响各器官的生理功能，微循环障碍参与多种疾病的病理过程，其中的炎症反应及血管内皮损伤可引起机体心、肺、肝、肾等多器官功能障碍，继而成为病人致残乃至死亡的重要病因之一[16-17]，而急性微循环障碍更是很多疾病发生的共同病理生理环节。微循环血流灌注量是反映微循环状态的一项重要参数，并能够在一定程度上阐释经络的代谢生理机制[18]。急性微循环障碍模型下，高黏滞胶体高分子右旋糖酐经静脉注射后，大鼠血浆及全血黏度急剧增加，红细胞聚集，血流阻力大幅度升高、血流减慢甚至停滞，而血浆黏度急剧改变，并通过刺激血管壁黏度感受器，引起血管运动机能改变。本研究中给予发酵饮品后，各组血流灌注量显著增加，提示玫瑰枸杞发酵饮品可以在一定程度上对抗高分子右旋糖酐所致的SD 大鼠微血管运动机能与血浆黏度改变等导致的微循环障碍作用。该结果提示玫瑰枸杞饮品在缓解急性微循环障碍方面有一定的临床应用前景。

中医学认为女性宫寒与肾虚、脾气虚、血虚、肝郁、痰湿、湿热、血瘀等原因有关。现在中医则以治疗肾虚为主。玫瑰枸杞二者滋补肝肾，养肝明目，活血止痛、清热解渴、理气平肝，本研究结果与玫瑰花和枸杞子的活血化瘀及行气活络作用相吻合，玫瑰枸杞发酵饮品是采用重瓣红玫瑰和枸杞子匀浆接种肠膜明串株菌肠膜亚种发酵所得。发酵工艺的运用具有很强的增效减毒功效，在很大程度上提高了药物本身活血化瘀的作用，可有效改善人体微循环，促进血液循环。根据本试验结果，玫瑰枸杞发酵饮品在改善微循环方面值得进一步研究和开发，为其未来的临床治疗和应用提供了一定思路和试验基础。