植物乳杆菌Zhang-LL及其培养上清液对酒精损伤干预效果评价

马京升，张红星，谢远红，金君华

当今世界酒文化盛行，饮酒者与饮酒量日益增加，慢性酒精损伤作为一种常见的酒精相关疾病，主要包括酒精性肝损伤[1]，酒精性神经损伤[2]，酒精性胃损伤[3]，酒精性生殖系统损伤[4]，酒精性骨髓及造血系统损伤[5]，酒精性免疫系统损伤，酒精性致癌[6]，对其治疗方面研究很有必要。慢性酒精损伤的成因比较复杂，尽管大家一直关注这方面的研究，但其机理尚未明确[7-8]。近些年来，不少益生菌表现出对慢性酒精损伤的治疗效果，特别是在胃损伤、肝损伤、肠道损伤方面的治疗效果良好，且尚未报道副作用，受到学术界广泛关注[8-9]。有确切证据表明，酒精性肝病与肠上皮顶端交界复合体被破坏，黏膜屏障功能障碍以及肠道内脂多糖或内毒素进入体循环有关[10]。研究表明植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌CCFM1107、发酵乳杆菌ZYL0401、发酵乳杆菌LA12、长双歧杆菌LC67、长双歧杆菌LC27 及长双歧杆菌LC67 和LC27 混合物可以通过降低肠道通透性，增强肠道黏膜屏障功能等途径来减轻酒精诱导的肠道上皮损伤及肝脏损伤，然而益生菌对于酒精损伤的干预效果及其作用途径具有菌株特异性[8，11-14]。植物乳杆菌Zhang-LL 具有良好的胃肠道耐受性，易定植于生物胃肠道内[15-16]。使用植物乳杆菌Zhang-LL 对葡聚糖硫酸钠诱导的慢性溃疡性结肠炎大鼠进行干涉，发现其可有效改善大鼠的体态、肠道形态、通透性、菌群结构以及免疫能力[17]。本研究将低、高剂量植物乳杆菌Zhang-LL 活细胞及无细胞的发酵上清液与酒精同时灌胃给ICR 小鼠，在12 周的试验周期结束后评价植物乳杆菌Zhang-LL 在酒精损伤对机体负面影响方面的缓解作用。

1 材料与方法

1.1 试验原材料与试剂

1.1.1 试验菌株 本试验使用的植物乳杆菌Zhang-LL（Lactobacillus plantarum Zhang-LL，CGMCC 6939），北京农学院功能乳品实验室保藏菌种。

1.1.2 实验动物 SPF 级ICR 小鼠90 只，体重（34±2）g，7 周龄，雄性。小鼠集中在中国农业大学清洁级实验动物房喂养，湿度：50%～60%，温度：20～23 ℃，标准配方杆状饲料喂养，垫料为玉米芯垫料或木须垫料，完全自由进水进食。

1.1.3 溶液的配制[18]KHBB 缓冲液：8.4 mmol/L HEPES 缓冲液，119 mmol/L NaCl，4.7 mmol/L KCl，1.2 mmol/L MgSO4，1.2 mmol/L KH2PO4，25 mmol/L NaHCO3，2.5 mmol/L CaCl2，11 mmol/L 葡萄糖pH 7.4。

FITC-dextran 溶液：用1 mL KHBB 溶液溶解40 mg 异硫氰酸荧光素（FITC，FD-4，Sigma），配制成40 mg/mL 的溶液。

1.2 试验方法

1.2.1 植物乳杆菌的活化及传代处理 活化：取冻存植物乳杆菌Zhang-LL 保菌液，在液体MRS培养基试管内，37 ℃条件下培养活化，并传代2次，取3 代在4 ℃下6 000 r/min 离心10 min，保留上清液。用灭菌的生理盐水配制浓度为1.0×108CFU/mL 和1.0×1010CFU/mL 的菌体活细胞悬液，将离心所得上清液通过0.22 μm 无菌滤膜处理，用于灌胃。

1.2.2 实验动物分组与处理 ICR 小鼠1 笼5 只分笼喂养，自由进食饮水，定时更换垫料。适应性喂养1 周后，根据体重随机分成5 组，每组15 只小鼠。分别为空白对照组、模型组、植物乳杆菌Zhang-LL 低剂量组、植物乳杆菌Zhang-LL 高剂量组、植物乳杆菌Zhang-LL 上清组。

表1 灌喂方法Table 1 The method of feeding

1.2.3 实验动物的检测指标

1）小鼠体重及一般情况 试验期间，定时更换垫料，保持饮食饮水条件正常。每天称重饲料剩余质量、饲料添加质量、剩余水量、添加水量。通过这些数据计算出每笼小鼠日进食量、摄水量，观察小鼠外观、行为、伤亡等情况，每周定期集中给每只小鼠称重1 次。

2）小鼠血清及器官采取 血清：12 周末小鼠禁食不禁水12 h 后称重并眼球采血，室温凝固1 h 后3 500 r/min，15 min 离心后置于-20～-70 ℃低温贮藏待用。使用全自动生化分析仪测定小鼠血清的总甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）指标，使用试剂盒测定天门冬氨酸氨基转移酶（AST）（南京建成，货号C010-2-1）、小鼠血清谷氨酸氨基转移酶（ALT）（南京建成，货号C009-2-1）。

脏器：断颈处死小鼠后立刻采集小肠、肝脏等，4 ℃生理盐水漂洗后滤纸拭干，称重器官后液氮保存。脏器指数的计算方法为内脏质量/大鼠体重×100%。

3）小鼠肝匀浆制备 解剖后采集小鼠肝脏右叶组织，盐水漂洗滤纸擦干称重后剪成碎块，加入9 倍组织体积的生理盐水（4 ℃），并于玻璃匀浆管匀浆化处理，制备成10%肝匀浆，3 000 g，离心15 min，留上清液待用。肝匀浆-20～-70 ℃低温保藏[19]。

4）小鼠肝脏匀浆指标的测定 肝脏匀浆中AST 和ALT 活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA） 含量及还原性谷胱甘肽（GSH）含量的测定，使用南京建成生物研究所相应试剂盒进行测定。

5）肝脏病理切片制作 将肝脏组织于10%的中性福尔马林溶液中固定4～6 h；再用85%乙醇溶液浸泡90 min，95%乙醇40 min 2 次，无水乙醇45 min 3 次，二甲苯10 min 2 次；于54～56 ℃石蜡中浸泡30 min 2 次；用82 ℃硬蜡+蜂蜡包埋，室温保存；用切片机制备4 μm 厚切片；70 ℃烤箱烘烤45 min；最后HE 染色并进行显微镜读片[20]。

6）肠道切片制作 取2 cm 小肠组织，生理盐水冲洗后放入福尔马林溶液固定。经修块水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、透明、封固等步骤，制成厚5 μm 的HE 染色组织切片，显微镜下观察小肠绒毛形态[21]。

7）小鼠肠通透性测定 取10 cm 源于KHBB 缓冲液（pH 7.4）的新鲜回肠组织，结扎线结扎一端，灌胃针从另一端注入100 μL FITCdextran 溶液后将另一端结扎，形成8 cm 的肠管。将其置于2 mL 的KHBB 液体，37 ℃恒温箱孵化20 min。荧光分光光度法激发波长485 nm、发射波长530 nm 测定肠管中渗透至孵化缓冲液中的FD-4 溶液。测定每分钟每厘米小肠FD-4 渗透量，得到小肠的通透性数据[22]。

8）小鼠肠道菌群分析 根据文献中报道方法提取小鼠粪便基因组[17]，利用二/三代测序平台，对16S rDNA 功能基因等特定区段PCR 产物进行高通量测序，获得肠道样本中的微生物群落结构以及与环境相关性等信息。本研究由美吉生物公司对样本进行测序，并通过I-Sanger 云平台进行分析。通过门水平、属水平上肠道菌群的改变来分析各试验组菌群结构的变化，并进行相似性聚类分析。

1.3 统计学分析

试验数据采用SPSS22.0 软件选用Duncans法进行单因素方差分析、显著性分析，显著性水平为P<0.05，指标结果为平均值±标准差（±s）。除动物试验均做3 次重复试验。

2 试验结果与分析

2.1 实验动物的一般情况

对照组小鼠皮毛光泽柔顺、体态活泼、体重正常、反应灵敏、进食饮水正常、无嗜睡现象。模型组和植物乳杆菌各组小鼠从试验第3 周灌胃酒精开始，出现皮毛粗糙无光、体态呆板、体重下降、反应迟缓、食欲减退、精神萎靡等症状，醉酒行为明显，一般经2～3 h 后可缓解。较于模型组，植物乳杆菌各组小鼠醉酒症状轻，醒酒时间短；但与对照组小鼠相比，植物乳杆菌干预各组小鼠体态消瘦、食欲欠佳、持续死亡。总体来看，植物乳杆菌各组小鼠情况劣于对照组，优于模型组。

2.2 植物乳杆菌Zhang-LL 对小鼠体重的影响

酒精对消化系统的刺激破坏，会降低动物的消化能力使其体重降低。植物乳杆菌通过磷壁酸与肠黏膜上皮细胞结合形成生理屏障，减少来自酒精的损伤[11，18]。研究结果显示所有分组小鼠体重在第0 到2 周适应期内呈明显逐渐上升的趋势，从第3 周起给各组加灌生理盐水或酒精，对照组小鼠体重呈上升趋势且一直为同一时期各组中最大值。模型组小鼠则体重增长缓慢，体重一直处于同时期各试验组中的最小值（图1a）。体重指标表明，长期摄入酒精已经显著影响小鼠的正常生长，体重增加减缓。从12 周的体重数据分析，模型组的小鼠体重显著低于其它各试验组，植物乳杆菌各干预组（低高剂量活细胞组及无细胞上清组）的小鼠体重没有显著性差异，与对照组也没有显著性差异，表明植物乳杆菌Zhang-LL 可以显著缓解长期摄入酒精对机体生长的负面影响。在已有报道中，尚未发现正常食物饲喂情况下酒精摄入后会引起机体体重的显著变化[11，23]，但本研究挑选第12 周作差异显著性分析，结果显示对照组与各植物乳杆菌Zhang-LL 干预组之间没有显著性差异，但均显著高于模型组（P＜0.05）（图1b）。试验结果表明，植物乳杆菌Zhang-LL 的低、高剂量及其培养上清液均可以显著缓解醉酒剂量摄入乙醇带来的体重减轻的影响。

图1 植物乳杆菌Zhang-LL 对小鼠体重的影响Fig.1 The effect of Lactobacillus plantarum Zhang-LL on the body weight of mice

2.3 植物乳杆菌Zhang-LL 对小鼠食欲的影响

研究结果表明，长期摄入一定量的酒精会导致胃黏膜出血、溃烂，影响酶活性，减退动物食欲和消化能力，使机体代谢紊乱，影响进食[18]。本研究针对试验周期内各组小鼠的饲料摄入量及饮水量进行统计，结果显示模型组小鼠的饲料摄入量约为对照组（1888.0 g）的55.1%（P<0.05）（图2a），饮水量为对照组（2 307.7 mL） 的51.6%（P<0.05）（图2b），表明模型组小鼠体重降低可能由于进食量降低引起。另外，数据表明植物乳杆菌Zhang-LL 各干预组的饮水量为1 826.8～1 860.1 mL 显著低于对照组，显著高于模型组（图2a）；但饲料摄入量为1 492.9～1 671.3 g，与对照组没有显著性差异，显著高于模型组（图2b）。数据结果表明植物乳杆菌Zheng-LL 可以显著缓解醉酒剂量摄入乙醇给机体食欲带来的负面影响，保持机体的正常食物摄入量。

图2 植物乳杆菌Zhang-LL 对小鼠饮食量的影响Fig.2 The effect of Lactobacillus plantarum Zhang-LL on the diet amount of mice

2.4 植物乳杆菌Zhang-LL 对小鼠血脂代谢的影响

慢性酒精损伤会增高血脂水平，使脂肪变性产生脂肪泡。酒精会阻碍体内脂肪代谢，其代谢产物乙醛等抑制脂肪酸分解。这时，进入氧化代谢途径的游离脂肪酸减少，TG 合成代谢途径的增多，血清TG 水平上升[13，23]。由图3a 可知，试验周期结束时模型组血清中TG 含量并未发生显著变化，与对照组没有显著性差异（P>0.05）。但植物乳杆菌高剂量组、上清组的血清TG 含量明显降低，尤其是上清组的血清TG 含量显著低于模型组，甚至显著低于对照组（P＜0.05），表明植物乳杆菌Zhang-LL 的无细胞培养上清液具有影响机体脂质代谢，减少TG 合成，降低血液中TG 的作用，甚至在酒精损伤情况下，依然具有显著的作用效果。

低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）主要来自小肠和肝脏。LDL-c 将肝脏中胆固醇运输到其它组织器官，当血液胆固醇过量时，来自LDL-c 的胆固醇开始堵塞血管壁，减小血管内径，严重干扰机体生化代谢[13]。本研究结果显示，试验周期结束时，模型组血清中的LDL-c 的含量显著高于对照组（P＜0.05），模型组较对照组升高了3 倍。而植物乳杆菌Zhang-LL 低剂量组较模型组降低了75%，高剂量组降低了50%，上清组降低了58.3%，3 组与对照组差异无显著性（P＞0.05），均显著低于模型组（图3b），结果表明植物乳杆菌Zhang-LL 可以缓解酒精损伤增加机体低密度脂蛋白积累的负面影响。

图3 植物乳杆菌Zhang-LL 对小鼠血清甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的影响Fig.3 The effect of Lactobacillus plantarum Zhang-LL on triglycerides and low density lipoprotein cholestero in mice serum

还原型谷胱甘肽（GSH）由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成，是一种低分子清除剂。它通过巯基与自由基结合，清除O2-，H2O2，加速自由基排出。它增强含琉基酶稳定性，防止血红蛋白和其它辅因子氧化损伤，GSH 水平用来衡量机体抗氧化能力，是肝脏受损伤程度的指标[18，24]。如图4所示，模型组<对照组<植物乳杆菌Zhang-LL 上清组<植物乳杆菌Zhang-LL 低剂量组<植物乳杆菌Zhang-LL 高剂量组，植物乳杆菌Zhang-LL 高剂量组、低剂量组、上清组GSH 含量是模型组1.77 倍、3.23倍、1.6 倍，模型组小鼠肝脏匀浆GSH 水平与植物乳杆菌Zhang-LL 各组差异均有显著性（P＜0.05），对照组与植物乳杆菌Zhang-LL 高剂量组、低剂量组差异均有显著性。这说明植物乳杆菌Zhang-LL可明显提高鼠肝脏匀浆GSH 水平，提升机体抵御氧化损伤的能力。

图4 植物乳杆菌Zhang-LL 对小鼠肝脏谷胱甘肽含量的影响Fig.4 The effect of Lactobacillus plantarum Zhang-LL on glutathione content in mice liver

2.5 植物乳杆菌Zhang-LL 对小鼠肠道功能的影响

2.5.1 对小肠组织的影响 小肠是动物吸收营养物质的主要场所，其功能性依赖于正常黏膜形态结构。小肠黏膜上皮的皱襞、绒毛、微绒毛等特殊结构扩大了其吸收养分的表面积，其中小肠绒毛作为小肠黏膜主要结构，是衡量小肠吸收功能重要指标，酒精会影响小肠绒毛形态[10，22]。通过观察图5小肠绒毛组织切片可知，对照组小肠绒毛致密完整，长且宽；模型组绒毛密度稀疏，明显损伤脱落，短且窄；植物乳杆菌Zhang-LL 上清组小肠绒毛粗壮致密，高度较对照组高。本研究认为植物乳杆菌Zhang-LL 上清液在消除酒精对小肠绒毛的损伤作用的基础上还能促进其生长。

图5 小鼠小肠绒毛HE 染色Fig.5 HE staining of mice small intestinal villi

2.5.2 对小鼠小肠通透性的影响 肠黏膜通透性指某特定物质在肠黏膜表面非易化扩散的渗透能力。肠道对大分子物质通透性增加说明肠道结构发生改变，可能有肠道内细菌或内毒素渗漏，通过肠道屏障进入血液循环。本研究用肠道对大分子物质通透性来评估肠道黏膜屏障功能[22，25]。大量研究显示，长期摄入酒精可损伤肠道，增加肠通透性，延迟肠道上皮细胞迁移更新，严重时会导致克罗恩病、糖尿病、乳糜泻、肠易激综合征（IBS）、特异性皮炎等疾病[14，22]。由图6可知，试验周期结束时，模型组的小肠通透性与对照组相比并未产生显著性变化，但植物乳杆菌Zhang-LL 的高剂量组及上清组可以显著降低小肠的通透性，尤其是上清组，小肠通透性已经显著低于对照组。吴思琪等对植物乳杆菌Zhang-LL 预防肠炎机理研究的结果表明，植物乳杆菌Zhang-LL 可以显著提高肠道组织中紧密连接蛋白表达量，从而降低肠道的通透性，阻挡肠道内部毒素等物质渗透到血液中，缓解肠炎症状[11，17，22]。该结果与本研究结果相似，表明植物乳杆菌Zhang-LL 的确有降低肠道通透性的作用效果，维持肠道绒毛的完整状态，从而减少不利机体健康物质渗入血液，保持机体的肠道健康功能。

图6 植物乳杆菌Zhang-LL 对小鼠小肠通透性的影响Fig.6 The effect of Lactobacillus plantarum Zhang-LL on intestinal permeability of mice

2.6 植物乳杆菌Zhang-LL 对小鼠肠道菌群结构的影响

利用Illumina 高通量测序平台分析不同乳酸菌菌株对因长期酒精摄入改变小鼠肠道菌群结构的影响。初步分析结果表明：长期摄入酒精显著改变小鼠的肠道菌群结构，外源摄入植物乳杆菌菌株Zhang-LL 后小鼠的菌群结构与对照组小鼠及模型组小鼠的差异具有显著性（图7a），但相对于模型组，对照组与Zhang-LL 菌株各受试组小鼠菌群结构有更接近的相似性（图7b）。表明植物乳杆菌Zhang-LL 可以显著缓解由于长期摄入酒精引起的肠道菌群紊乱。

图7 植物乳杆菌菌株Zhang-LL 各组受试物组的小鼠肠道菌群结构相似性树状图Fig.7 The tree of structural similarity of the intestinal microflora of mice in the Lactobacillus plantarum Zhang-LL test groups

2.7 植物乳杆菌Zhang-LL 对小鼠其它指标的影响

除上述指标外，本研究还观察了各组试验小鼠肝脏组织病理切片，检测了肝脏、脾脏及肾脏的脏器指数，以及血清及肝脏组织中的ALT、AST 酶活、MDA 含量以及GSH-Px 酶活，但模型组、各干预组及对照组之间的这些指标均未出现显著性差异，推测为期12 周的酒精灌胃试验影响了小鼠与机体健康相关的部分指数，但对肝脏并未产生病理性的改变。有研究报道显示，10～14 mL/kg/d 的48%或60%的乙醇灌胃量会导致小鼠发生显著的醉酒行为学表现[26-27]。本研究中灌胃剂量的后8 周的50%的灌胃剂量为5.7～7.1 mL/kg/d（约0.2～0.25 mL/d/只），少于文献报道中的醉酒剂量，然而小鼠已出现醉酒行为，结果表明，在试验周期内，虽然持续以使小鼠出现醉酒的剂量进行灌胃，但是未使小鼠的肝脏出现病理性改变。

3 结论

植物乳杆菌Zhang-LL 干预可以显著缓解酒精损伤引起摄食量减少及体重增长减缓的负面影响（P<0.05）。与模型组相比，植物乳杆菌Zhang-LL培养上清液还可以显著降低酒精损伤的小鼠血清中TG 及LDL-c 的水平，增加肝脏组织中GSH 的含量，降低肠道通透性，保持小肠绒毛的完整性，平衡肠道菌群结构（P<0.05）。在试验周期内，摄入酒精小鼠的肝脏组织结构未出现酒精损伤的病理性改变，组织及血液中ALT 酶活、AST 酶活，组织中MDA 含量及GSH-Px 酶活均没有显著变化，植物乳杆菌Zhang-LL 各干预组对这些指标也没有显著影响（P>0.05）。总体来看，植物乳杆菌Zhang-LL 对酒精摄入给机体带来的部分负面影响具有显著的改善作用，尤其以植物乳杆菌Zhang-LL 培养上清液作用效果最为显著。