基于DNA条形码和矿物元素指纹的三文鱼物种鉴定和产地溯源技术

王紫晔，王正亮，黄 珏，俞晓平

三文鱼，学名大西洋鲑（Salmo salar），属鲑科鲑属鱼类，因具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇、富含维生素、味道鲜美等诸多优点而深受中国消费者喜爱[1]。由于三文鱼是冷水洄游性鱼类，其生存条件较为苛刻，因此我国暂无法大规模养殖，主要依赖进口。近年来一些不法商家为牟取暴利，在三文鱼鱼肉及其制品的贸易过程中掺假、造假，以次充好。例如：2018年5月有媒体报道，国内市场上近三分之一的进口三文鱼由青海龙羊峡产的虹鳟鱼“承包”。而这些被媒体所曝光的恐怕也只是市场混乱现状的冰山一角。如何加强进口三文鱼质量安全管理，有效保障消费者权益，是当前急需解决的问题，而建立三文鱼真伪鉴别和产地溯源技术体系是解决上述问题的有效办法。

在物种真伪鉴别领域中，基于DNA 的分子检测是目前国际上最具权威的方法[2-4]。然而，随着检测需求的日益变化，现有方法（如基因芯片技术和分子指纹图谱技术）在一定程度上存在操作程序耗时费力、鉴定结果精确性低等诸多不足[5-6]。DNA条形码是以便捷、低廉的DNA 提取、扩增和测序技术为前提的一项新兴生物物种鉴定技术，它是通过一个标准化的短基因片段（即 “DNA 条形码”）的序列变异来鉴定物种的，如动物线粒体细胞色素c 氧化酶亚基I（cytochrome c oxidase subunit I，COI）[7]。近年来，DNA 条形码作为食品掺假、制假鉴别的关键技术已在食品贸易中广泛应用。如Khaksar 等[8]利用DNA 条形码技术研究美国市售鱼类，发现标签错误率高达16.3%。Quinto等[9]使用DNA 条形码方法对美国市场上的54 种野味样本进行分析，发现有18.5%的样品被贴错标签，甚至其中9.3%的样品为濒危物种。

在产地溯源领域，近十多年来国际上主流的技术是基于矿物元素指纹图谱和稳定同位素质谱检测方法，同时结合以近红外光谱、电子舌等为代表的现代无损分析模式，分别针对地理环境形成的矿物元素组成、同位素分布以及产品品质差异等特征性指标来判定产品的地理来源[10-12]。其中，矿物元素在某种程度上反映了动、植物的生长环境，可提供样品地理来源特征信息，已广泛应用于水产品的产地溯源[13-15]。如Li 等[16]利用ICP-OES测定太平洋白虾中Al、As、Ba、Ca、Co、Cr、Cu 等20种元素的含量作为分析变量，结合主成分分析等方法建立的判别模型能够成功判别太平洋白虾的地理来源。Zhao 等[17]通过矿物元素分析了马尼拉蛤体内矿物元素的组成，发现Mg、Cd、Sn、Ba、Ce 5种元素可作为马尼拉蛤地域判别的有效指标。

我国食品溯源研究还处于起步阶段，目前相关研究主要集中于地理标志性产品的保护，而在进口食品质量安全追溯中的应用研究不多[18-20]。本文以进口高附加值水产品——三文鱼为对象，研究建立以DNA 条形码技术为核心的三文鱼真伪鉴别技术，评估矿物元素指纹图谱技术在三文鱼产地溯源应用中的可行性，以期为建立和完善我国进口水产品质量安全识别体系提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究中三文鱼样本购自浙江北极品水产有限公司，其中挪威三文鱼样本43 份，智利三文鱼样本42 份。为了保证研究材料的均一性，所有三文鱼样本均为带皮鱼身中段，质量控制在1.0 kg/样本左右。所有样本置于-20 ℃冰箱中冷冻保存。

1.2 三文鱼DNA 条形码获取及序列分析

1.2.1 DNA 提取、PCR 扩增及测序 三文鱼基因组DNA 采用DNeasy Tissue Kit（Qiagen，Hilden，Germany）试剂盒抽提。取三文鱼背部肌肉组织，置于研钵中，加入液氮充分碾磨后，按照试剂盒说明书操作步骤进行DNA 提取，提取的基因组总DNA 于-20 ℃保存备用。采用鱼类DNA 条形码通用引物FF2d（5’-TTCTCCACCAACCACAARGAYATYGG-3’）和FR1d（5’-CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3’）扩增线粒体COI 基因序列[21]。PCR 反应总体积为25 μL，其中模板DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，Premix Taq 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，运行35 个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR 终产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送上海桑尼生物科技有限公司进行双向测序。

1.2.2 公共序列下载、筛选及数据分析 从Gen-Bank 数据库中下载与本研究扩增区段一致的鲑科鱼类COI 基因序列，通过比对BOLD 数据库对序列准确性进行进一步验证。结合本研究所得的COI 基因序列，最终共获得隶属于29 种鲑科鱼类的99 条基因序列（表1）。使用MEGA 6.0[22]进行多序列比对，去除两端冗余序列。分析处理后序列的核苷酸组成、变异位点及密码子组成等。基于Kimura-2-parameter（K2P）模型计算种间和种内遗传距离[23]，以邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，经1 000 次重复抽样检测其置信度。

表1 29 种鲑科鱼类COI 基本信息Table 1 Information of COI sequences from 29 Salmonidae species

（续表1）

1.3 三文鱼矿物元素组成测定及溯源分析

1.3.1 样品预处理 三文鱼中段鱼肉切小块后分装冷冻于-80 ℃冰箱中备用。样品处理方法参照郭波莉[24]的方法并做适当调整，随机取部分样品置于烘箱70 ℃烘至恒重后，用陶瓷研钵和研杵将其研磨至鱼粉。

1.3.2 矿物元素含量测定 准确称取0.3000 g 磨碎的鱼粉，置于干燥消化管中，加入6 mL 浓硝酸（65%，分析纯），置于MARS 微波消解仪（美国CEM 公司）中，通过逐步增加功率至1 600 W 并将温度升高至185 ℃消化40 min。冷却至室温后加200 μL H2O2（30%，分析纯）于消化管中，置于电热消解仪中赶酸，赶酸温度为160 ℃。最终得到约1 mL 的澄清透明溶液，转移至50 mL 离心管中，用从Milli-Q 系统中获得的超纯水（18.2 MΩ·cm）定容至50 mL 待用。用Elan DRC-e 型ICP-MS（美国Pekin Elmer 公司）测定样品中Cd、Ag、Pb、Fe、Cu、Zn、Al、Sr、Ni、As、Cr、V、Se 等13 种元素含量，使用OPTIMA 8000 ICP-OES（美国Pekin Elmer公司）测定样品中Mn、K、Ca、Na 和Mg 5 种矿物元素的含量。用不含样品的空白对照校正仪器读数。每个样品重复测量3 次，计算的每个值为3 次测定的平均数。

ICP-MS 工作条件：射频功率1 300 W，雾化器气体流速0.87 L/min，雾化室温2 ℃。采用美国Agilent 公司的环境标样为标准样品，以内标元素Ge 和In 保证仪器的稳定性。

ICP-OES 工作条件：射频功率1 300 W，等离子气体流速：15 L/min，辅助气体流速：0.2 L/min，雾化器气体流速：0.8 L/min，样品流速：1.5 L/min。

1.3.3 数据处理 运用SPSS 21.0 软件对数据进行方差分析、判别分析以及主成分分析。使用Microsoft Office Excel 2010 进行雷达图分析。

2 结果与分析

2.1 三文鱼DNA 条形码的物种鉴别有效性评估

2.1.1 COI 基因片段序列分析 本研究PCR 所获COI 序列及GenBank 下载序列共99 条，经MEGA 6.0 软件比对后，修剪成长度为561 bp 的共有片段进行后续分析。结果显示561 个位点中，保守位点368 个，可变位点193 个，简约信息位点192个。在碱基组成上，A、T、G、C 的平均含量为分别为22.9%，30.1%，17.9%，29.1%。A+T 总含量为53.0%，C+G 总含量为47.0%。各密码子的碱基含量结果显示，第3 密码子位点GC 含量（54.1%）显著高于第1 和第2 密码子位点（42.8%和44.3%），碱基使用频率表现出明显A+T 碱基偏向性。

2.1.2 遗传距离分析 对COI 基因的K2P 遗传距离分析结果表明，钝吻细鳞鲑（Brachymystax tumensis）的种内遗传距离最大（0.0135），基氏白鲑（Coregonus kiyi）、霍氏白鲑（Coregonus hoyi）、银鲑（Oncorhynchus kisutch）、远东哲罗鱼（Parahucho perryi）、大西洋鲑（Salmo salar）、北极红点鲑（Salvelinus alpinus）、北极茴鱼（Thymallus arcticus）以及茴鱼（Thymallus thymallus）等鱼的种内遗传距离均为0，种内平均遗传距离为0.001。种间的遗传距离介于0.002～0.229 之间，平均遗传距离为0.150（表2）。种间平均遗传距离远远大于种内平均遗传距离（约150 倍），满足 “10 倍规则”，表明COI 基因作为DNA 条形码能对29 种鲑科鱼类进行有效的物种鉴定[25]。

表2 基于COI 序列的鲑科鱼类种内及种间遗传距离Table 2 Genetic divergences（K2P）at the species level for salmon taxa based on COI sequence

2.1.3 系统进化树分析 基于29 种鲑科鱼类99条COI 序列，利用邻接法（Neighbor joining）构建分子系统进化树（图1）。结果显示，同一物种的鲑科鱼类均能聚集在同一分支内，且均获得较高的支持率。此外，属级分类单元的单系性也得到了显著体现，如鲑属、白鲑属、茴鱼属和大麻哈属分别形成独立的进化分支，均表现为单系群。因此，基于NJ 树构建分析的方法亦表明COI 基因可以作为DNA 条形码标记有效区分本研究中的29 种鲑科鱼类。

图1 基于29 种鲑科鱼类COI 序列构建的邻接树Fig.1 The neighbour-joining trees analysis of 29 Salmonidae species based on K2P distances of COI

2.2 基于矿物元素指纹的三文鱼产地溯源可行性分析

2.2.1 挪威和智利三文鱼矿物元素含量差异 ICPMS 与ICP-OES 测定结果显示，挪威和智利三文鱼中Cd 与Ag 的矿物元素含量低于可检测值。通过对其它16 种矿物元素含量进行多重比较分析，结果显示Fe、Zn、Al、Ni、As、Cr、V、Se、Ca、Na 10 种矿物元素在地域间有显著差异（表3）。部分元素的标准偏差偏大，导致变异系数较大（如Mn、Sr、V等）。鱼类体内的矿物元素含量的影响因素有很多，例如饲料水平、年龄、性别、水中的矿物组成、捕捞季节等[26-30]，因而相同地域中三文鱼体内的矿物元素含量差异也会较大。

表3 挪威和智利三文鱼的矿物元素含量Table 3 Mineral element content of Salmo salar from Norway and Chile

（续表3）

2.2.2 挪威和智利三文鱼中矿物元素含量主成分分析 为探讨矿物质元素对三文鱼产地判别的影响，以此建立判别模型，本研究对三文鱼中地域间存在显著差异的10 种元素进行主成分分析，提取特征值大于1 的3 个主成分，由表4可知前3 个主成分的累计方差贡献率为76.845%，可充分达到反映原始信息的目的。从主成分特征向量图（图2）中可以看出第1 主成分主要综合了V、Fe、Cr、Ni、Zn 和Na 等6 种元素的含量信息，第2 主成分主要反映了Al 的含量信息，第3 主成分主要综合了Se、Ca、As 等3 种元素的含量信息。

图2 3 个主成分的特征向量雷达图Fig.2 Characteristic vector radar diagram of three principal components

表4 主成分分析的特征向量及累计方差贡献率Table 4 Eigenvector and cumulative variance contribution rate of principal components

2.2.3 挪威和智利三文鱼中矿物元素含量判别分析 利用Fe、Zn、Al、Ni、As、Cr、V、Se、Ca、Na 等10种含量在地域间有显著差异的矿物元素进行线性判别分析。利用Fisher 函数、交叉检验进行判别分析。将所有样品分为训练集和验证集，选择2/3 的样本作为训练集建立模型，1/3 的样本作为验证集，以验证建立的溯源模型的准确性。具体判别模型如下：

Y挪威=-84.010+0.184Fe+0.600Zn+0.193Al-1.290Ni+4.925As-0.089Cr-20.323V+17.449Se-0.721Ca+1.555Na

Y智利=-138.722+0.194Fe+0.873Zn+0.157Al-0.668Ni+4.283As-0.893Cr-24.471V+28.240Se-0.429Ca+0.962Na

利用上述判别模型对样品归类，由表5可以看出，此模型对三文鱼产地来源的整体判别正确率为98.8%，交叉验证结果的正确率亦为98.8%。说明Fe、Zn、Al、Ni、As、Cr、V、Se、Ca、Na 对三文鱼产地的判别效果较好。

表5 挪威和智利三文鱼矿物元素判别分析结果Table 5 Discriminant analysis results of mineral elements for Norwegian and Chilean salmon

3 结论

基于K2P 模型对8 属29 种鲑科鱼类的COI序列的遗传距离分析显示，平均种间遗传距离为0.150，是平均种内遗传距离（0.001）的150 倍，表明各物种间具有明显的物种边界。基于COI 基因序列以邻接法构建的系统发育树中同一物种均单独聚为一支。由此可见，基于COI 基因的DNA 条形码技术能够对本研究中29 种鲑科鱼类有效实现“种”水平上的鉴定。矿物元素指纹分析显示在挪威和智利进口三文鱼中矿物元素存在显著性差异，其中Fe、Zn、Al、Ni、As、Cr、V、Se、Ca、Na 可作为鉴定其原产地的有效指标。基于这10 种矿物元素所建立的判别模型的正确判别率达98.8%，研究结果证明了矿物元素指纹是实现挪威与智利进口三文鱼产地溯源的有效方法。