水果制品中丙烯酰胺含量的分布

王鹏璞，卢 佩，孙国玉，陈 芳

丙烯酰胺（Acrylamide，AA）是热加工食品中的一种伴生危害物，对人具有神经毒性、基因毒性和潜在致癌性[1-4]，被国际癌症研究机构归为2A 类致癌物[5]。食品中的AA 主要通过还原糖和天冬酰胺在高温下发生美拉德反应形成[6-7]。马铃薯制品、咖啡及其替代品、谷物类早餐等富含碳水化合物的热加工食品中含量较高。根据欧洲食品管理局2015年的报道[8]，薯片类小吃中AA 暴露量达580 μg/kg，咖啡及咖啡替代品中高达703～1 499 μg/kg。

早期研究表明水果制品中AA 含量极低或未检出。部分干制水果如杏脯（180 μg/kg）、枣干（70 μg/kg）、香蕉干（50 μg/kg）、香蕉脆片（770 μg/kg）等[9-10]中含有一定量的AA。中国部分市售果汁（苹果汁、葡萄汁、橙汁等）中AA 平均含量仅约为20 μg/kg[11]。2015年，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）发布的食品中AA 含量报告数据显示：西梅汁和罐装黑橄榄中AA 含量分别高达200 μg/kg 和500 μg/kg[12]。针对加拿大市面上出售的42 种西梅制品AA 暴露量的研究表明，不同西梅产品中AA 含量差异显著，西梅汁中AA 含量为186～916 μg/kg，西梅干中为58～332 μg/kg，婴幼儿西梅干中为75～265 μg/kg，婴幼儿苹果-西梅混合果汁却仅有33～61 μg/kg[13]。市售黑橄榄中AA 含量范围由未检出到高达2 326 μg/kg[10]，当灭菌温度在110～125 ℃时，产品中AA 含量随加热时间的增加而显著增加[14-15]。目前尚缺乏常见水果制品中AA 含量数据。我国是世界最大的水果生产国和水果制品加工基地，因此有必要针对不同加工方式的水果制品中AA含量进行调查。本文针对5 类市售水果制品中AA含量进行检测，为水果制品中AA 风险评估和控制技术开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验原料 在美廉美超市及京东商城采购不同品牌市售水果制品58 种，根据加工方式的不同分为五类：果汁（23 种）、果脯（12 种）、果酱（9种）、罐头（4 种）和水果脆片（10 种），涉及18 个产地、23 个生产厂家，所选样品具有代表性。

1.1.2 主要试剂 AA 标准品（纯度>99.8%），美国Sigma 公司；13C3-AA 标准溶液（纯度>99%），美国Cambridge Isotope Laboratories 公司；色谱级乙腈、甲醇和甲酸，美国赛默飞世尔科技有限公司；分析纯氯化钠、正己烷和无水硫酸镁，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters ACQUITY I-CLASS 超高效液相色谱仪，美国Waters 公司；Xevo TQ-S 三重四级杆串联质谱仪（电喷雾ESI 电离源），美国Waters 公司；KQ-2200 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；PURELAB Classic 超纯水机，北京龙跃伟逸科贸有限公司；CF16RXII 高速离心机，日本Hitachi 公司；JP-300B 高速多功能食品粉碎机，永康市久品工贸有限公司；EFAA-DC24-RT 防腐型24位氮吹仪，上海安谱实验科技股份有限公司；Vortex-5 漩涡振荡器，江苏其林贝尔有限公司；Cleanert-PEP SPE 柱（60 mg/3 mL）和聚醚砜微孔滤膜（0.22 μm，13 mm），天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 AA 的提取及纯化

1.3.1.1 固体样品 根据袁媛[16]和杨斯超[17]的方法并稍加修改。样品冻干后粉碎，称取1 g（精确至0.01 g）于50 mL 离心管中，加入10 mL 正己烷脱脂，振荡1 min，4 ℃、10 000 r/min 离心15 min，弃上清。重复上述脱脂过程两次。向沉淀中依次加入20 μL13C3-AA 溶液（120 mg/L）、10 mL 超纯水、10 mL 乙腈、4 g MgSO4及1 g NaCl，振荡混匀并超声15 min，4 ℃、10 000 r/min 离心15 min，取上清，氮气吹干后用1 mL 超纯水复溶。依次用3 mL 甲醇及3 mL 超纯水对SPE 柱进行活化，将复溶后所得溶液过SPE 柱，收集流出物。再加1 mL 超纯水淋洗SPE 柱，合并2 mL 流出液，振荡混匀，过0.22 μm 聚醚砜水系滤膜后注入棕色样品瓶中，待UPLC-MS/MS 检测。

1.3.1.2 液体样品

1）果汁 根据Wang 等[3]研究中液体样品处理方法并稍加修改。用超纯水将果汁样品稀释5倍，取2 mL 加入20 μL13C3-AA 溶液（120 mg/L），振荡混匀后，4 ℃、10 000 r/min 离心15 min。取1 mL 上清溶液过SPE 柱（预先活化）纯化，后续操作同1.3.1.1 节。

2）其它液体样品：样品不经过稀释，其它处理内容同果汁样品。

1.3.2 AA 的UPLC-MS/MS 检测

1.3.2.1 色谱条件 根据Wang 等[3]的方法并稍加修改。选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱温40 ℃，进样量5 μL，流动相及液相分离条件如表1所示。

表1 UPLC 主要参数Table 1 Main parameters for UPLC

1.3.2.2 质谱条件 阳离子电喷雾电离源（ESI+）；扫描模式：MRM；脱溶剂气温度：500 ℃；脱溶剂气流量：900 L/h；锥孔反气流量：150 L/h；离子源温度：150 ℃；源偏置电压：60 V；雾化器压力：7.0 Bar；毛细管电压：2.9 kV；锥孔电压：25 V；碰撞能量：11 eV；驻留时间：0.03 s；定量离子对：AA m/z 72.0→55.0，13C3-AA m/z 75.0→58.0。

1.3.2.3 检测方法评价 配制1 g/L 的AA 标准品溶液，通过梯度稀释方法配制质量浓度范围为5～1 000 μg/L 的AA 标准溶液。分别于各浓度溶液中加入20 μL13C3-AA 内标溶液（120 mg/L），混匀，过0.22 μm 聚醚砜水系滤膜，进行UPLC-MS/MS检测。以标准溶液浓度为横坐标，AA 与13C3-AA的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归分析计算。分别以被分析物的色谱峰信噪比为3 和10 时的浓度为方法的检出限（Limit of Detection，LOD）和定量限（Limit of Quantification，LOQ），取6 次平行试验的平均值。精密度由相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）表示，日内精密度和日间精密度分别由高（500 μg/L，n=5）、中（50 μg/L，n=5）、低（5 μg/L，n=5）3 个质量浓度的标准溶液在1 d 内重复测定6 次（日内精密度）和连续测定6 d（日间精密度）得到。

1.4 数据分析

使用软件IBM SPSS 20.0 进行数据统计和回归分析。

2 结果与分析

2.1 方法评价

对所用UPLC-MS/MS 方法进行评价，结果表明在给定的质量浓度范围（5～1 000 μg/L）内，标准曲线线性关系良好（R2=0.9983），所得回归方程为y=3.2638x+0.0042；日内精密度为RSD（5μg/L）=3.39%、RSD（50μg/L）=1.35%、RSD（500μg/L）=1.73%，日间精密度为RSD（5μg/L）=10.56%、RSD（50μg/L）=1.95%、RSD（500μg/L）=1.59%，均低于15%，精密度高；LOD 为0.692 μg/L，LOQ 为2.384 μg/L，灵敏度好，满足痕量物质的测定。

2.2 果汁中AA 含量分布

选取的23 种市售果汁饮料（国产：葡萄汁、橙汁2 种、桃汁、苹果汁、石榴复合果汁、橙/胡萝卜/苹果/菠萝/猕猴桃/樱桃李复合果汁、芒果/菠萝/番石榴/苹果/番茄/橙/西柚复合果汁、苹果香蕉汁、红心番石榴汁、西柚汁；进口：菠萝汁、姜味甘蔗汁、荔枝汁、葡萄汁、苹果芒果复合汁、苹果汁2 种、复合果汁、樱桃汁、西梅汁、橙汁、胡萝卜汁）中仅美国产西梅汁有AA 检出，质量浓度为（377.00±22.17）μg/kg，与文献报道水平相当[13]，这与其特殊制作工艺有关。西梅汁是先将新鲜西梅在85～90℃条件下热风干燥处理18 h 以上制得西梅干，再将西梅干置于沸水中煮至可溶性固形物含量约为18%[18]，烘干和煮沸过程中加热时间较长，导致其中含有较高浓度的AA。Becalski 等[13]也发现将西梅汁于95 ℃条件下加热24 h，其中AA 含量显著升高。除西梅汁外其它果汁均未检出AA，这与前期研究（果汁中AA 平均含量为20 μg/kg）[11]不一致。一方面，果汁的低pH 值（pH 3～4）[19]抑制美拉德反应使AA 本身的形成降低；另一方面，不同产地和品牌果汁的生产工艺不同。比如产地北京的葡萄汁、橙汁、桃汁、苹果汁、石榴复合果汁及保加利亚的樱桃汁在生产过程中采用超高温瞬时杀菌（Ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT）和无菌冷灌装工艺，与传统的热灌装相比使杀菌和罐装的加热时间大大缩短。在以上工艺使用的基础上，产地杭州的两类6 种水果复合果汁还保证混合果蔬汁浓度在30%；而同产地的橙汁、苹果香蕉汁，湖州的红心番石榴汁、西柚汁，西班牙的橙汁和苹果汁对鲜果进行冷压榨出汁，不经浓缩及复原过程，这在缩短加热时间的同时保留了丰富的膳食纤维和多种维生素，而这些都可以使加工过程中AA 的形成显著降低[20-21]。

2.3 果脯中AA 含量分布

表2所示为果脯制品中AA 含量。如表所示，所选10 种果脯制品中8 种AA 含量为（19.24±0.61）～（147.22±5.12）μg/kg，果丹皮和太平脯中AA 未检出。与果汁样品相比，果脯样品中AA 检出率80%，这是由于二者加工工艺不同所致。果脯是以新鲜水果为原料，经预处理后用糖液煮制、脱水干制得到的水果制品[22]。首先，为了保持品质，避免“返砂”现象出现，要求煮制果品的糖液含糖量70%左右，其中还原糖占总糖60%；同时还需要在特定pH 值下长时间煮制使蔗糖完全转化。最后，脱水干制还需进一步经热风干燥或晾晒处理[23-24]。因此，还原糖含量高、高温长时间处理是导致果脯中AA 普遍形成的主要原因。8 种被检出产品中美国西梅的AA 含量最高，但显著低于西梅汁，与文献[13]报道一致。这是因为西梅汁是在西梅干基础上进一步进行长时间煮制而得到的。

表2 不同果脯类制品中AA 含量Table 2 AA contents in different commercial preserved fruits

2.4 果酱中AA 含量分布

如表3所示，所选9 种果酱制品AA 检出率100%，质量浓度范围（25.65±3.83）～（64.93±5.46）μg/kg，整体较果脯中高。果酱是将新鲜水果经预处理后加糖煮至可溶性固形物含量达到指定要求的凝胶制品。首先，与果脯相比，果酱无需保持果块形状，其浓缩煮制时间更长。其次，果酱利用果胶在脱水剂（糖）作用下形成凝胶的原理制得，要求果胶含量在1%左右，而果胶酸水解形成的半乳糖醛酸可显著促进AA 的形成[25]。另外，果酱加工过程中原料漂烫、果浆浓缩及灭菌等环节均涉及热处理[26-27]。因此，长时间高温处理和果胶的含量是果酱中普遍检出AA 的原因。

表3 不同果酱制品中AA 含量Table 3 AA contents in different jams

2.5 水果罐头中AA 含量分布

表4所示为不同罐头产品中AA 含量的检测结果。所选4 种产品的固形物中AA 检出率100%，范围为（20.07±2.74）～（41.66±3.37）μg/kg。水果罐头加工中涉及的热处理工艺有原料漂烫、注液、排气和杀菌[28-29]，不同水果原料适宜的热处理温度及时间不同，导致固形物中AA 含量存在差异。所选4 种产品的糖液中均未检出AA。这是因为罐头糖液是将白砂糖、柠檬酸等加入热水中预先煮制后再转移至盛有预处理后水果的容器中，进一步排气和灭菌[29-30]，糖液在长时间煮制过程中缺少含氨基化合物作为反应底物，难以形成AA。

表4 不同罐头中AA 含量Table 4 AA contents in different canned fruits

2.6 水果脆片中AA 含量分布

水果脆片是近年来出现的一类新型水果制品，因其具有原果风味、口感优良、低脂低热、便于携带、易于储存等备受消费者青睐。如表5所示，所选10 种市售水果脆片中AA 检出率80%，范围在（17.49±2.56）～（87.74±7.90）μg/kg 之间，产地徐州的黄桃脆和产地烟台的草莓脆中AA 未检出。水果脆片主要通过水果原料脱水加工而成，加工方法有真空油炸、微波膨化、冷冻干燥、微波真空等[31]。如表所示，相较于产地烟台的低温真空油炸黄桃脆，采取冷冻干燥脱水工艺的徐州产黄桃脆无AA 检出，这说明不同加工方式及加工温度显著影响产品中AA 的形成。同为冷冻干燥，徐州产榴莲脆中AA 含量高于烟台产，这可能与产品品种及原料中前体物含量不同有关。另外，在8 种被检出水果中榴莲脆、红枣脆和椰子脆的AA 含量最高，与其它水果相比，这几种水果碳水化合物和氨基酸含量丰富[32-33]，这为AA 的形成提供了丰富的前体物。

表5 不同水果脆片中AA 含量Table 5 AA contents in different fruit chips

3 结论

本研究利用UPLC-MS/MS，对国内市场上5类（果汁、果脯、果酱、水果罐头和水果脆片）共58种水果制品中的AA 含量进行了测定。结果表明各类水果制品中均含有一定量AA，但不同种类及加工方式的水果中AA 含量差异较大。其中西梅类制品中AA 含量最高；在果汁中除西梅汁外均未检测到AA；果脯（除西梅干）、罐头、果酱、水果脆片中AA 含量均低于100 μg/kg。研究结果为水果制品中AA 风险评估和控制提供依据。另外，低pH 值本身抑制AA 的形成，但西梅汁pH 值为3.8～3.9，加热温度低于100 ℃，在所有水果制品中AA 含量却最高；果酱加工pH 值为2.8～3.3，但其AA 检出率却为100%，这驱使我们在后续研究中继续探究水果中是否富含具有更高反应活性的美拉德反应底物导致AA 的形成，这对于生产健康水果制品有重要意义。