类干酪乳酪杆菌PC-01的鉴定和生物学特性及其在活菌型乳酸菌饮料中的应用

张 哲，郭 帅，于学健，辛 亮，姚 粟*

类干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）属于厚壁菌门（Firmicutes），芽孢杆菌纲（Bacilli），乳杆菌目（Lactococcus），乳杆菌科（Lactobacillaceae），乳酪杆菌属（Lacticaseibacillus）。类干酪乳酪杆菌是典型的革兰氏阳性细菌，广泛存在于干酪、发酵乳、泡菜等发酵食品以及人体的口腔、肠道中，兼性厌氧、不运动、不产生芽胞，是典型的同型乳酸发酵乳酸菌，同时也是常见的益生菌候选菌株[1-3]。类干酪乳酪杆菌这一分类最早是在1989年由Collins 等[4]提出，将原干酪乳杆菌的4 个亚种归为副干酪乳杆菌这一新的菌种，并指定ATCC 25302T 为其模式菌株，在2020年乳杆菌属分类发生变化，副干酪乳杆菌归为乳酪杆菌属，并更名为类干酪乳酪杆菌[5]。

类干酪乳酪杆菌具有研究、使用历史悠久，安全性高的优点。在我国国家卫生健康委员会发布的《可用于食品的菌种名单》[6]以及欧盟食品安全委员会发布的QPS[7]（qualified presumpyion of safety）名单中，类干酪乳酪杆菌（副干酪乳杆菌）均位列其中。类干酪乳酪杆菌还具有良好的耐酸、耐胆盐特性，经过人体胃、肠道依旧能大量存活，发挥其益生特性[8]。近年来，类干酪乳酪杆菌不仅应用在干酪等传统发酵制品中，在单菌株低温发酵的活菌型乳酸菌饮料中应用也很广泛。例如：每益添由类干酪乳酪杆菌LC-431 发酵而成，优益C则选用类干酪乳酪杆菌LC-37，味全活菌型乳酸菌饮料选用了类干酪乳酪杆菌LC-01。3 种产品中活菌数均达到3×1011CFU。类干酪乳酪杆菌应用于活菌型乳酸菌饮料中，不仅拥有良好的发酵特性，还能在贮藏期保持高活菌数。

本研究以分离自西藏拉萨地区当雄县龙仁乡自然发酵酸牦牛奶中的具有良好消化液耐受性及安全性的类干酪乳酪杆菌PC-01 为对象，基于菌株在不同温度、pH 值下生长情况及其碳源、氮源利用能力对其进行鉴定和生物学特性研究，同时评价其在活菌型乳酸菌饮料中的发酵特性，为该菌株后续开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株 菌株PC-01 由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程” 教育部重点实验室提供，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.17537。对照菌株类干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）LC-01，购自科汉森（中国）有限公司。

1.1.2 试验试剂 MRS 培养基、革兰氏染色试剂盒，北京陆桥技术股份有限公司；蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸粉、大豆蛋白胨、牛肉膏、乳糖，北京奥博星生物技术有限责任公司；蔗糖，北京化工厂；半乳糖，北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖、乳糖，广东西陇化工厂；甘露糖，麦克林中国；琼脂粉，青岛海博生物技术有限公司；API 50 CHL 试剂条，生物梅里埃公司；溶菌酶、RNase A 溶液、Gold-View，北京全式金生物技术有限公司；高通量测序试剂套装BGISEQ-500RS（PE100）、通用DNA 文库制备试剂套装（MGIEasy），深圳华大智造科技有限公司；Qubit®dsDNA HS Assay Kit、Qubit®ss-DNA Assay Kit，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒E.Z.N.A.®Bacterial DNA Kit，Omega Bio-tek 公司；脱脂乳粉，新西兰恒天然集团。

1.1.3 试验仪器与设备 立式低速离心机，德国Eppendorf 公司；光学显微镜Olympus BH-2，奥林巴斯有限公司；pH 计Five Easy，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；恒温培养箱BHG-8082 型，上海一恒科学仪器有限公司；高压灭菌锅HG-50，日本HIRAYAMA 公司；Q800R2 超声打断仪，美国Sonicator 公司；Qubit 3.0 核酸荧光定量仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 活化与培养 将冻存于甘油管中的类干酪乳酪杆菌PC-01 以2%接种量接种于MRS 液体培养基中，在37 ℃下静置培养24 h，传代2～3 次后使用。或将冻存于甘油管中的类干酪乳酪杆菌PC-01 取一接种环于MRS 琼脂培养基上四区划线，在37 ℃下静置培养48 h 后选取单菌落划线，传代2～3 次后使用。

1.2.2 菌株PC-01 多相分类学鉴定 按照细菌基因组DNA 提取试剂盒E.Z.N.A.®Bacterial DNA Kit 操作规程提取各菌株基因组DNA，使用MGIEasy 通用DNA 文库制备试剂套装进行建库，将符合出库标准的文库按照BGISEQ-500RS 高通量测序试剂套装的说明书完成DNA 纳米球的制备、加载和上机测序。使用SOAPnuke v1.5.6 对下机原始数据进行过滤，去除接头序列、PCR 重复序列和低质量碱基序列（Phred 得分<20），利用SPAdes v3.11.0 进行序列拼接，获得组装基因组序列[9-10]。以模式菌株类干酪乳酪杆菌类干酪亚种（Lacticaseibacillus paracasei subsp.paracasei）JCM 8130T（GCF_000829035.1）、类干酪乳酪杆菌坚韧亚种（Lacticaseibacillus paracasei subsp.tolerans）DSM 20258T（GCF_001436485.1）为参考菌株，利用fastaANI（v 1.3）软件对测序菌株进行ANI 分析。

将菌株PC-01 通过四区划线接种到MRS 琼脂培养基上，于37 ℃培养48 h 后，观察培养基上菌落的形态特征[11-12]。使用API 50CH 鉴定系统对菌株PC-01 底物利用能力进行测定[13]。

1.2.3 菌株PC-01 生物特性研究 挑取MRS 琼脂培养基上新鲜单菌落接种到5 mL MRS 液体培养基中，在37 ℃下静置培养24 h 后作为接种种子液。

菌株在不同温度下生长能力测定：将种子液以2%接种量接种于5 mL MRS 液体培养基中，分别放置于15，25，30，35，37，45，50 ℃培养箱中静置培养24 h，测定发酵液在600 nm 下吸光值（OD600nm）。

菌株在不同pH 值下生长能力测定：将种子液以2%接种量接种于初始pH 值为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0 和11.0 的MRS 液体培养基中，37 ℃静置培养24 h，测定发酵液在600 nm 下吸光值（OD600nm）。

菌株的最适生长温度及产酸能力测定：根据菌株在不同温度下生长能力试验结果，选择菌株最适生长温度区间。将种子液以2%接种量接种于5 mL MRS 液体培养基中，分别放置于30，32.5，35 及37 ℃培养箱中静置培养，每隔4 h 测定发酵液的pH 值及600 nm 下吸光值（OD600nm），并对发酵液进行活菌计数，绘制菌株在不同温度下的生长曲线。

不同碳源、氮源对菌株生长的影响：将种子液以2%接种量接种于单碳源（葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、甘露糖）或单氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、硫酸铵）MRS 培养基中，于37 ℃静置培养24 h，测定发酵液在600 nm 下吸光值（OD600nm）[14-16]。

1.2.4 菌株PC-01 对活菌型乳饮料的发酵特性及产品的贮藏稳定性

1.2.4.1 活菌型乳饮料的制备及类干酪乳酪杆菌的发酵特性 质量分数13.5%的脱脂乳粉和质量分数2.5%的葡萄糖于45 ℃水合30 min 后分装，121 ℃7 min 灭菌褐变，将类干酪乳酪杆菌PC-01及类干酪乳酪杆菌LC-01 分别以5×106CFU/mL接入冷却后的褐变乳中，于37 ℃发酵120 h，制备发酵基料，同时测定第0，24，48，72，96，120 h 发酵基料pH 值。

将柠檬酸∶乳酸=1∶2 配置30%酸液，95 ℃灭菌5 min，冷却至20 ℃备用。

将发酵基质∶白砂糖∶蒸馏水=25∶12∶63 混合，并用酸液调pH 值至3.7，于20 MPa 均质后无菌灌装，将产品分别置于4，10 ℃贮藏[17]。

1.2.4.2 活菌型乳饮料的贮藏稳定性 将4，10℃贮藏的活菌型乳酸菌饮料分别于0，7，14，21，28 d 取样，测定pH 值、滴定酸度及活菌数[18]。

pH 值测定：将活菌型乳酸菌饮料放置室温后，采用精密pH 计测定。

滴定酸度测定：将活菌型乳酸菌饮料放置室温后，按照国标GB 5009.239-2016[19]所规定的“酚酞指示剂法”进行测定。

活菌数测定：采用稀释涂布平板法进行测定。

2 结果与分析

2.1 菌株PC-01 多相分类学鉴定

菌株PC-01 在MRS 琼脂培养基上37 ℃培养48 h，菌落呈乳白色，圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐。在显微镜下观察，革兰氏染色阳性，菌体呈现杆状，单个或成对成串出现，菌体大小为0.4～0.5 μm×0.6～2.7 μm。其利用碳源产酸能力见表1。

图1 菌株PC-01 菌落形态（a）与菌株PC-01菌体形态（b）Fig.1 Colony morphology of strain PC-01（a）and bacteria morphology of strain PC-01（b）

表1 菌株PC-01 的API 分析结果Table 1 API analysis results of strain PC-01

对菌株PC-01 和参考菌株进行全基因组测序，测序结果显示试验菌株测序深度大于300×，全基因组序列Q30 均在90%以上，满足后续组装及分析要求。ANI 于2007年由Goris 等[20]提出，两个基因组序列之间的整体相似性，可以通过比较两基因组之间的平均核苷酸一致性指出，ANI 值95%～96%与DNA-DNA 杂交值的70%相对应，可作为细菌物种鉴定的有效方法。选取模式菌株类干酪乳酪杆菌类干酪亚种JCM 8130T 和类干酪乳酪杆菌坚韧亚种DSM 20258T 的全基因组序列作为参考序列进行ANI 分析，结果表明，菌株PC-01 与两株模式菌株全基因组序列的ANI 值分别为98.17%和98.06%，菌株PC-01 鉴定为类干酪乳酪杆菌（原副干酪乳杆菌）。

2.2 菌株PC-01 生物学特性

菌株生长pH 值范围试验结果如图2所示，在培养基的起始pH 值为3～9 时，菌株PC-01 均能生长。随着起始pH 值的升高，发酵液中生物量先上升后下降，在起始pH 值为7.0 时，菌株PC-01 生长最旺盛。PC-01 生长pH 值范围广，且对酸碱有着良好的耐受性，PC-01 在pH 值为2.5 的模拟胃液中处理3 h 后，转移至pH 值为8.0 的模拟肠液中继续消化8 h，通过活菌计数，菌株PC-01在经过消化液后存活率为88.6%，有良好的消化液耐受性。能以活菌状态进入人体肠道是益生菌的基本要求。

图2 不同起始pH 值下菌株PC-01 生物量Fig.2 Biomass of strain PC-01 at different initial pH

菌株生长温度范围试验结果表明（图3），菌株PC-01 生长温度范围为15～50 ℃。随着培养温度的升高，PC-01 的生物量呈现先升高后降低的趋势，最适生长温度范围为30～37 ℃，当培养温度达到50 ℃及以上时，菌株几乎不生长。根据PC-01 生长温度范围结果，选取30，32.5，35，37 ℃对菌株PC-01 进行生长曲线及产酸能力的测定。

图3 不同培养温度下菌株PC-01 生物量Fig.3 Biomass of strain PC-01 at different temperatures

通过菌株PC-01 在不同培养温度下的活菌数绘制的菌株生长曲线（图4a），可以看出，在30，32.5，35，37 ℃这4 个温度下，菌株PC-01 均在培养4 h 后进入对数生长期。在35 ℃和37 ℃两个培养温度下，PC-01 于16 h 进入稳定期；在30 ℃和32.5 ℃两个培养温度下，PC-01 于20 h 进入稳定期。到达稳定期后，30 ℃和32.5 ℃两个温度下培养液中的活菌数可以达到35 ℃和37 ℃两个温度下活菌数的2～3 倍。根据菌株PC-01 在4 个温度下的产酸曲线（图4b）可以看出，在前24 h，温度越高，pH 值下降速率越快；在第36 h，4 个温度下发酵液的pH 值均下降到3.8。菌株PC-01 在相对较低的生长温度下生长更快且稳定期活菌数更高，具有制备单菌株低温长时间发酵活性乳酸菌饮料的潜力。

图4 不同温度下菌株PC-01 的生长曲线（a）和产酸曲线（b）Fig.4 Growth curve（a）and acid production curve（b）of strain PC-01 at different temperatures

以无碳源MRS 培养基为基础，在不改变其它成分的情况下，添加20 g/L 单一碳源。结果如图5a所示，菌株PC-01 在以半乳糖为碳源的MRS 培养基中生长24 h 后，发酵液的吸光度最高，达到2.42；同时在以葡萄糖、乳糖和甘露糖为碳源的MRS 培养基中，菌株生长情况也十分优异，发酵液吸光度均在2.0 以上；菌株PC-01 对蔗糖的利用能力最差。

以无氮源MRS 培养基为基础，在不改变培养基其它成分的条件下，添加25 g/L 单一氮源。结果如图5b 所示，在以酵母浸粉为单一氮源的MRS培养基中，菌株PC-01 生长24 h 后发酵液的吸光度明显高于其它氮源，可以达到3.0 以上；同时，PC-01 对牛肉粉和大豆蛋白胨的利用能力也很好，发酵液吸光度可以达到2.0 以上；PC-01 对酪蛋白胨、蛋白胨和硫酸铵的利用能力较差。

图5 菌株PC-01 对不同碳源（a）和氮源（b）的利用能力Fig.5 The utilization ability of strain PC-01 to different carbon sources（a）and nitrogen sources（b）

2.3 菌株PC-01 对活菌型乳酸菌饮料的发酵特性及产品的贮藏稳定性

将菌株PC-01 应用于活菌型乳酸菌饮料的发酵，以商业化发酵剂类干酪乳酪杆菌LC-01 为对照，以5×106CFU/mL 接种量进行接种，在37 ℃下恒温发酵120 h。由图6a 可以看出，在起始菌量相近的情况下，菌株PC-01 发酵褐色乳饮料中活菌数增加更快。在发酵过程中，LC-01 和PC-01 发酵乳pH 值变化情况趋于一致（图6b），无显著差异（P＞0.05）。

图6 活菌型乳酸菌饮料发酵过程活菌数（a）和pH 值变化（b）Fig.6 Changes in the number of viable bacteria（a）and pH（b）during the fermentation process of living lactic acid bacteria beverage

将以PC-01 和LC-01 制备的活菌型乳酸菌饮料分别置于4，10，25 ℃下贮藏28 d，贮藏期内饮料的pH 值及滴定酸度变化见图7a、7b。可以看出在不同的贮藏温度下，PC-01 及LC-01 制备的饮料pH 值及滴定酸度变化趋势一致。随着贮藏时间的延长，温度越高pH 值下降越快，同时滴定酸度上升越快，产品后酸化越明显。在4 ℃及10 ℃的贮藏条件下，PC-01 及LC-01 制备的饮料在贮藏期内产品pH 值均保持在3.0 以上。

根据活菌型乳酸菌饮料在贮藏期内产品活菌数的变化（图7c）可以看出，随着贮藏时间的延长，在4 ℃及10 ℃的贮藏条件下，产品的活菌数有所下降但维持在一个稳定的范围内，PC-01 与LC-01 发酵产品活菌数在贮藏期内无显著差异（P＞0.05）。PC-01 发酵产品在4 ℃及10 ℃的贮藏温度下，活菌数由10.5×107CFU/mL 分别下降到5.72×107CFU/mL 和 5.52×107CFU/mL；商业化菌株LC-01 发酵产品在4 ℃及10 ℃的贮藏温度下，活菌数由10.20×107CFU/mL 分别下降到5.86×107CFU/mL 和5.57×107CFU/mL。当贮藏温度为25℃时，两株菌株发酵产品在贮藏期内活菌数显著下降，在第28 天时，产品中活菌数相较4 ℃及10℃贮藏样品下降了一个数量级。但3 个贮藏温度下，两组产品在贮藏期内活菌数均高于国标GB 7101-2015[21]及国标GB 21732-2008[22]中所要求的活性乳酸菌饮料在货架期内最低乳酸菌含量1.00×106CFU/mL。

图7 活菌型乳酸菌饮料在不同贮藏温度下pH 值（a）、滴定酸度（b）和活菌数（c）变化Fig.7 Changes in pH（a），titrated acidity（b）and viable bacteria count（c）of the lactic acid bacteria beverage with live bacteria at different storage temperatures

3 结论

本研究通过多相分类学鉴定技术对分离自西藏拉萨地区当雄县龙仁乡自然发酵酸牦牛奶中的菌株PC-01 进行鉴定。结果表明，菌株PC-01 符合乳杆菌的典型特征，通过全基因组测序比对分析，该菌株鉴定为类干酪乳酪杆菌（原副干酪乳杆菌）。

通过对菌株PC-01 的生物学特性研究表明，该菌株对pH 值耐受范围广，在培养基起始pH 值为3～9 时生长良好，与其对人工胃肠液良好的耐受性相一致，这也是菌株发挥其潜在益生特性的必要条件。通过菌株PC-01 生长温度范围试验及其在不同温度下的生长曲线可知，菌株PC-01 的最适生长温度为32.5 ℃，在该温度下，PC-01 生长、产酸速度快，且到达稳定期时活菌数高。通过菌株PC-01 对单一碳源、氮源MRS 培养基的发酵试验表明，碳源方面，该菌株对半乳糖及葡萄糖的利用能力强；氮源方面，该菌株对酵母浸粉的利用能力最强。综合上述生物学特性，菌株PC-01 在相对低温条件下生长、产酸能力强，具有做单菌株低温发酵活菌型乳酸菌饮料发酵剂的潜力。

本研究将菌株PC-01 用于发酵活菌型乳酸菌饮料，并以商业化菌株LC-01 为对照。在相同发酵时间下，菌株PC-01 与LC-01 产酸速率没有显著差异，在相同时间到达发酵终点，且发酵终产品活菌数更高。在4 ℃及10 ℃的贮藏条件下，两组产品在贮藏期始终保持高活菌数。在不同贮藏温度下，PC-01 发酵产品与LC-01 发酵产品pH值及滴定酸度随时间变化趋势一致。利用菌株PC-01 发酵活菌型乳酸菌饮料，可与市售商业化菌株达到相同的效果，PC-01 具有巨大市场应用潜质。