食源性混合病原菌生物被膜行为对金黄色葡萄球菌毒素因子转录水平的影响

陈忠军，张钰皎，胡炜东，孙子羽，苏 杰，满都拉*

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）和大肠杆菌（Escherichia coli）是主要的食源性病原菌，它们极易在食品加工过程中形成混合菌生物被膜。混合菌生物被膜是自然界多种微生物为适应胁迫环境，通过分泌胞外多糖等基质而形成的有利于生存的微生物集落。混合菌生物被膜更难以被清除，从而导致食品腐败等食品安全性问题[1-3]。金黄色葡萄球菌是一种常见的人、畜共患病病原菌，不仅会造成细菌性食物中毒，还会对食品加工人员造成危害[4]。金黄色葡萄球菌的致病性主要与其分泌的多种毒素因子有关，包括肠毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）、黏附素（Adhesion factors）、溶血素（hemolysin，HL）、杀白细胞素（Panton-Valentine leucocidin，PVL）、脱皮毒素（Exfoliatives，ETs）、中毒性休克综合征毒素（toxic shock syndrome toxin，TSST）和凝固酶（Coagulase，CaL）等[5-8]。

本文对食源性混合病原菌生物被膜（金黄色葡萄球菌-大肠杆菌-沙门氏菌）进行定性和定量检测，以其中优势菌（金黄色葡萄球菌）为研究对象，通过对其特有的28 种目的毒素基因的定量，计算单一菌和混合菌生物被膜中金黄色葡萄球菌特有毒素基因转录水平的差异，旨在进一步分析生物被膜中金黄色葡萄球菌的致病性，并为其有效防治提供依据。

1 材料与设备

1.1 材料

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC 26003-3、大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 11775-3、肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）ATCC 14028，中国普通微生物菌种保藏管理中心；结晶紫、氯化钠、0.1mol/L PBS、草酸铵、甲醇、冰醋酸，上海国药集团化学试剂有限公司；Trizol试剂，天根生化科技（北京）有限公司；Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR®Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus），ROX plus、DL2000 DNA Marker，TaKaRa（宝生物）；胰蛋白胨大豆肉汤培养基（Tryptone Soy Broth，TSB），北京陆桥生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

TM4000 plus 扫描电镜，日本株式会社日立高新技术那珂事业所；Synergy H1 全功能微孔板检测仪，美国伯腾仪器有限公司；NANODROP 2000 分光光度计，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Tanon 1600 凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；ABI7500 荧光定量PCR 仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；LDZX 全自动高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；GHP 隔水式恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；QL-902 涡旋振荡仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Centrifuge 5415D 离心机，艾本德中国有限公司。

2 方法

2.1 食源性混合病原菌生物被膜的制备

将大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌活化后稀释至OD600nm=0.1（约为1.5×108CFU/mL）。经无水乙醇浸泡过夜的不锈钢片（0.5 cm×0.5 cm）放入TSB 试管中后灭菌，将3 种稀释液1∶1∶1 混合后以1%的接种量接种于上述TSB 试管，37 ℃下培养后取出不锈钢片，无菌PBS 轻轻漂洗3 次，去除浮游菌[9-10]。

2.2 食源性混合病原菌生物被膜的定性检测

2.2.1 银染法（AgNO3）对混合菌生物被膜形成能力的检测 按照2.1 节方法，分别培养0.5，1，3，5，7 d 后，将清洗后的透明玻璃片在2.5%戊二醛PBS 溶液中固定1 h；蒸馏水漂洗后用饱和氯化钙溶液结合15 min；蒸馏水浸泡清洗15 min；加入5%硝酸银溶液反应15 min；1%对苯二酚溶液浸泡2 min；蒸馏水漂洗后用5%硫代硫酸钠溶液固定2 min；蒸馏水漂洗干净后用普通光学显微镜观察[11]。

2.2.2 扫描电镜（SEM）对混合菌生物被膜形成能力的检测 按照2.1 节方法培养混合菌生物被膜，取出不同培养阶段（0.5，1，3，5，7 d）的不锈钢片，无菌PBS 漂洗3 次后放入4 ℃预冷的2.5%戊二醛中固定4 h；使用梯度乙醇脱水（50%，60%，70%，80%，90%乙醇中各浸泡10 min，100%无水乙醇浸泡2 次，15 min/次）；醋酸异戊酯置换2 次，15 min/次；样品临界点干燥并喷金后使用扫描电镜进行观察[12]。

2.3 食源性病原菌生物被膜的定量检测

2.3.1 结晶紫染色法对混合菌生物被膜量的检测将大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌稀释液1∶1∶1 混合，以1%的接种量接种于装有200 μL TSB 培养基的96 孔板中，37 ℃分别培养0.5，1，3，5，7 d。将培养液弃去后用300 μL 的无菌PBS冲洗3 次，60 ℃下干燥1 h，然后于每孔中添加200 μL 无水甲醇固定15 min，干燥后添加200 μL的2%结晶紫染液染色20 min，蒸馏水冲洗孔壁至冲洗液无色，干燥后于每孔中添加300 μL 的33%冰醋酸静置10 min，微孔板检测仪振荡10 min 后于630 nm 下测定吸光度值，不接菌TSB 作空白对照[13]。

相对OD 值（SI）可反映出生物被膜的形成量。SI=OD/ODC（ODC等于空白孔的平均值加上其3 倍标准差而得到的OD 值）可衡量生物被膜的形成能力：04 为大量生物被膜形成量（+++）[14]。

2.3.2 病原菌生物被膜的活菌数检测

2.3.2.1 单菌生物被膜的活菌数检测 将3 种病原菌的稀释液分别以1%的接种量接种于装有不锈钢片的TSB 试管中，37 ℃下分别培养6，12，24，36，48，72 h 后取出不锈钢片，无菌PBS 轻轻漂洗3 次以去除浮游菌。无菌棉棒刮擦其表面，然后将棉棒和不锈钢片一起放入盛有4 mL 无菌PBS 试管中，超声水浴10 min 并漩涡振荡后取菌悬液。然后于无菌PBS 液中做系列10 倍稀释，选择1 mL 适宜稀释度液加入无菌培养皿中，并倾注冷却至45 ℃的TSA 培养基中，37 ℃下培养48 h 后菌落计数，绘制生长曲线。

2.3.2.2 混合菌生物被膜的特定活菌数检测 将3 种稀释液1∶1∶1 混合后以1%的接种量接种于装有不锈钢片的TSB 试管中，按照2.3.1 节方法制备稀释液，选择1 mL 适宜稀释度液加入无菌培养皿中，并倾注冷却至45 ℃的Hektoen Enteric 琼脂培养基、Baird-Parker 琼脂基础培养基以及伊红美蓝琼脂培养基中，37 ℃下培养48 h 后菌落计数，绘制生长曲线[15-16]。

2.4 混合菌和单一菌生物被膜中金黄色葡萄球菌毒素基因表达量的差异

2.4.1 混合菌和单一菌生物被膜的建立及总RNA的提取 混合菌生物被膜和金黄色葡萄球菌生物被膜按照2.1 节的方法建立培养24 h 后，将漂洗干净的不锈钢片放入装有1 mL Trizol 试剂的试管中，振荡后严格按照Trizol 操作说明提取总RNA，每个样品3 个平行样[17]。

2.4.2 荧光定量PCR 相对定量毒素基因

2.4.2.1 逆转录合成 cDNA 采用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 进行 cDNA反转录，试验操作按产品说明书进行。

2.4.2.2 Real Time PCR 样本检测 试验对四大类的28 种金黄色葡萄球菌毒素基因进行荧光定量PCR 反应，引物均由北京Invitrogen 公司合成。以金黄色葡萄球菌标准菌（CMCC 26003-3）为对照样品，计算出单一菌和混合菌生物被膜中金黄色葡萄球菌28 种特有毒素基因转录水平的差异。每个样本均做3 个平行样。数据采用2-△△CT法进行分析：

表1 荧光定量PCR 反应引物序列Table 1 Primers sequences used for quantitative real-time PCR

（续表1）

3 结果与分析

3.1 银染法对混合菌生物被膜形态的观察

图1为培养0.5，1，3，5，7 d 混合菌生物被膜的形态，图中黑色絮状膜样物即为生物被膜。由图1a 可知，在培养0.5 d 时3 种病原菌的混合菌体生长速率较为缓慢，仅形成微量生物被膜且分布比较分散，因为此阶段为生物被膜黏附期，为生物被膜形成的第一步，此期的细菌形成量少且状态不稳定，食品工业中清除生物被膜常在此阶段进行。图1b 和图1c 时期的生物被膜形成量多，尤其在培养1 d 时，黑色絮状物紧密联结在一起形成大片生物被膜，在3 d 时的被膜量虽然有所减少，但仍有小片联结的生物被膜，随着微生物细胞的不断分裂增殖，并分泌了大量胞外多聚糖（EPS），此时单个细菌聚集形成微小集落以形成高度有组织的成熟生物被膜。成熟后的生物被膜随着培养时间的增加，其内的微生物细胞会快速增殖分散，致使一部分微生物脱落，如图1d、1e 所示，生物被膜已呈分散状态，仅有微量甚至是单个菌体存在[19]。

图1 不同时间段混合菌生物被膜的形态（×200）Fig.1 Morphology of mixed biofilms in different time periods（×200）

3.2 扫描电镜对混合菌生物被膜形态的观察

用扫描电镜观察0.5，1，3，5，7 d 的混合菌生物被膜形态（图2）发现，混合菌生物被膜的生长状态符合银染法观察到的黏附期-成熟期-脱落期三阶段。在0.5 d（图2a）时，微生物以单个形式存在，分布也较为分散；在1 d（图2b）时3 种病原菌分泌的胞外多糖等物质将自身及其余两种菌包裹后形成大片粘连紧密的生物被膜；由图2c 可清晰看出膜的网状结构，但此时的生物被膜已稍有松动趋势；处于脱落期（图2d、2e）的混合菌生物被膜只可见稀松的单个菌体和细菌分泌的胞外多糖及其它有机物质。由图2可知，在大肠杆菌-金黄色葡萄球菌-肠炎沙门氏菌的混合菌生物被膜中，球状菌体（金黄色葡萄球菌）明显大于杆状菌体（大肠杆菌和肠炎沙门氏菌）数量，这是因为在混合病原菌生物被膜中，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌存在竞争作用，优势菌（金黄色葡萄球菌）在生长过程中分泌的物质会抑制其它两株菌的生长[20]。

图2 不同时间段混合菌生物被膜的形态（×5 000）Fig.2 Morphology of mixed biofilms in different time periods（×5 000）

3.3 结晶紫染色法对混合菌生物被膜形成量的检测

采用结晶紫染色法对混合菌生物被膜形成量进行检测，结果见表2。

如表2所示，5 个时间段的SI 均大于1，即混合菌（大肠杆菌-金黄色葡萄球菌-沙门氏菌）在培养0.5，1，3，5 和7 d 均能形成生物被膜。在培养1 d 时为强黏附，混合菌生物被膜SI=4.11；0.5，3，5 d 均可生成中等量生物被膜（2

表2 不同时间段生物被膜的形成能力Table 2 Biofilm formation ability in different time periods

3.4 食源性病原菌生物被膜内活菌数的定量

图3和图4为3 种细菌单独及混合后其生物被膜中各个活菌数随时间变化的生长曲线。在单一菌生物被膜中（图3），大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌生物被膜活菌数均随培养时间的增加呈现先增加后减少的趋势，且在培养24 h 时活菌数目达到最大；金黄色葡萄球菌则明显高于其它两株。在混合菌生物被膜中（图4），各个菌株也均于培养24 h 时达到最大生长量，金黄色葡萄球菌在混合菌生物被膜中为优势菌。对比单一菌和混合菌生物被膜中各个活菌数可知，3 株菌在混合菌生物被膜中为相互竞争关系，分别通过分泌有机物质抑制了其余两株细菌的生长。以24 h 时来说，混合菌中的金黄色葡萄球菌活菌数目下降率为26.7%，大肠杆菌为23.2%，沙门氏菌为40.1%。

图3 单菌生物被膜中活菌数目Fig.3 Number of bacteria in single bacteria biofilm

图4 混合菌生物被膜中活菌数目Fig.4 Number of bacteria in mixed bacteria biofilm

3.5 混合菌和单一菌生物被膜中金黄色葡萄球菌毒素基因表达量的差异

根据Real Time PCR 原始检测结果，按照2-△△CT 相对定量计算，结果如表3所示。

由表3可知，28 种毒素基因均可在金黄色葡萄球菌标准菌中检出。相对于标准菌株，除单一菌中的hla、hld、etd 及混合菌中ser、hld 毒素基因外，其余基因表达量均低于标准菌。混合菌相较于单一菌生物被膜，金黄色葡萄球菌毒素基因表达量上调的有sea、sec、seg、sei、sej、sem、sep、ser、seu、hld、hlg、coa；下调的基因有sed、see、seh、sek、sel、sen、seo、seq、hla、hlb、pvl、eta、etb、etd、tst；混合菌中上调量显著的基因有sep、ser，显著下降的为hla、etd，其中seb 在单一菌和混合菌生物被膜中的表达量相等。

表3 Real Time PCR 检测相对定量结果Table 3 Real Time PCR detects relative quantitative results

金黄色葡萄球菌在感染过程中的主要致病毒素为肠毒素（SEs），SEs 易溶于水且耐高温，肉蛋乳等淀粉和蛋白质含量高的食品易被SEs 污染[21]，因此本研究对18 种调控肠毒素的因子（sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、sej、sek、sel、sem、sen、seo、sep、seq、ser 和seu）进行了相对定量，除ser 在混合菌生物被膜中表达量显著上调外，其余均比金黄色葡萄球菌标准菌表达量低。金黄色葡萄球菌溶血素（HL）能够破坏宿主红细胞从而引发血小管平滑肌收缩、局部缺血甚至坏死等问题[22]，研究的4 种溶血素调控因子（hla、hlb、hld 和hlg）检出率为100%，hla 在单一菌生物被膜中明显上调，hld 在单一菌和混合菌中表达量均显著增加。杀白细胞素（pvl）是金黄色葡萄球菌另一种毒素基因，可破坏宿主吞噬细胞而引发致死性肺炎[23]，Pvl 在生物被膜中微量下降。脱皮毒素（ETs）、中毒性休克综合征毒素（TSST）和凝固酶（CaL）为金黄色葡萄球菌的重要致病毒素[24-26]，调控基因除etd 在单一菌中表达量显著上调外，eta、etb、tst 和coa 均下降。

在食品工业中，金黄色葡萄球菌形成的生物被膜比浮游菌危害性大且更难以清除。虽然试验检测出生物被膜中的毒素基因大多比浮游菌的表达量低，但是由ica 操纵子（含icaA、icaB、icaC、icaD 基因）调控的多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesin，PIA）大量增加，使得生物被膜紧密联结在一起以便抵抗外部不良环境。混合菌生物被膜因多糖黏附素与复杂多样的胞外有机物质相互粘连进一步形成了更加完善紧密的微系统，使毒素可长时间作用于宿主且不易被外源药物杀灭[27-29]。

4 结论

本研究通过银染法和扫描电镜法对食源性混合病原菌生物被膜进行定性检测，使用结晶紫染色法对生物被膜的形成量进行测定，并通过平板菌落计数法对单一菌和混合菌生物被膜中的活菌数目进行定量。研究表明，混合菌在培养1 d 时即可形成成熟生物被膜；对其活菌数定量后发现金黄色葡萄球菌为优势菌，且其在混合菌生物被膜中生长量明显低于单一菌；进一步使用荧光定量PCR 发现，金黄色葡萄球菌28 种毒素因子在混合菌和单一菌生物被膜中表达量各不相同。金黄色葡萄球菌具有强致病性，且极易与其它病原菌形成混合菌生物被膜，增强了其致病性和难清除性。因此，在食品实际加工生产中应实时防控和灭菌，避免混合菌生物被膜造成食品细菌性污染等问题。