免疫亲和层析柱纯化大豆球蛋白多克隆抗体的研究

姚利利，席 俊，陈慧彬，陈 阳，皮江一，李 潘

大豆是人类食物过敏源之一[1]。调查表明，一般人群的大豆过敏患病率可能高达0.5%，而儿童高达13%[2]。据报道，至少有19 种大豆蛋白与大豆过敏患者的人血清IgE 结合，其中包含大豆球蛋白。大豆球蛋白结构复杂，为六聚体结构（两层三聚体组成），三聚体内部各多肽链通过二硫键和氢键配对交替连接在一起[3]。大豆球蛋白（Gly m 6）的变应原特性被广泛描述[4]。研究发现86%大豆过敏的患者的IgE 与Gly m 6（大豆球蛋白）结合[5]。关于大豆过敏蛋白的致敏表位鉴定一直是国内外学者研究的热点，而纯度高的目标抗体更有利于筛选和鉴定抗原表位。层析法和非层析法常用于抗体的纯化，一般非层析法后再进行层析纯化[6]。效果较佳的硫酸铵沉淀法为非层析法之一，收率达91%[7]。免疫亲和层析利用抗体和抗原的相互作用来纯化抗体[8]。该方法被用来促进低致敏性产品的开发[9-10]。抗原或者抗体偶联在柱填料上，具有高度选择性和较好的纯化效果[11-12]。本试验将大豆球蛋白偶联在免疫亲和层析柱填料上作为配基，进样的抗血清提前经硫酸铵沉淀，待目标抗体与大豆球蛋白充分反应吸收后洗脱2 次。首次非特异性洗脱物主要为其它非特异性抗体和杂蛋白，经特异性洗脱的为目标抗体。该亲和层析具有纯化过程简单、快速、产品纯度高等优点。该方法的应用将有利于大豆球蛋白过敏原的深入研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆球蛋白、抗大豆球蛋白多抗血清，实验室自制；CNBr activities sephrose 4B（免疫亲和层析柱），美国GE 公司；亲和层析柱、HRP 标记羊抗兔IgG、0.45 μm 滤膜，北京索莱宝科技有限公司；紫外检测仪，上海青浦沪西仪器厂；Multiskan 酶标仪、Nanodrop ND-2000 超微量核酸蛋白测定仪，美国Thermo 公司。

1.2 试剂配制

试剂的配制参照文献[13]，[14]的方法，试剂溶解均用超纯水，1 mmol/L HCl：取16.424 μL 的浓盐酸滴加入200 mL 超纯水并混匀。偶联液：取2.19 g NaHCO3，7.3 g NaCl 溶解并用2 mol/L HCl定容为250 mL，调pH 值至8.3。封闭液：取1.21 g Tris 溶解定容至100 mL 并调pH 值至8.0。平衡缓冲液：取1.45 g Na2HPO4·12H2O、0.1 g KH2PO4、4.0 g NaCl，0.1 g KCl 溶解并定容至500 mL。洗脱液：取0.75 g G1y，调pH 值至2.7 并定容至100 mL。再生A 液：取16.4 g 醋酸钠，5.84 g NaCl，溶解后定容至200 mL，并调pH 值至4.0。再生B 液：取2.42 g Tris，5.84 g NaCl 定容至200 mL 并调pH 值至8.0。Tris 中和液：取Tris 6.09 g 溶解并调pH 值为9.0，定容至50 mL。

1.3 试验方法

1.3.1 以大豆球蛋白为配基制备免疫亲和层析柱试验方法参照文献[13，14]并改进，取CNBr-activitied-Sephrose-4B 干粉0.6 g，用1 mmol/L HCl溶胀20 min，并用50 mL 1 mmol/L HCl 冲洗，用偶联液洗涤柱子，获得柱材约2 mL。用偶联缓冲液溶解大豆球蛋白粉末后过0.45 μm 水系滤膜（防止不溶性蛋白堵塞柱子），加入柱材与之充分混合，置于摇床上3 h，用偶联液洗涤未偶联蛋白，并收集全部冲洗液后测定蛋白浓度，计算柱容量。加入过量封闭液（含BSA），室温摇晃2 h，充分封闭未结合活性位点。长时间不用时，可加入0.02%NaN3抑菌，4 ℃保存。

1.3.2 免疫亲和层析纯化大豆球蛋白多克隆抗体参照文献[13]的方法并加以改进：（1）上样，封闭后将介质转入3 mL 柱子，用平衡缓冲液洗涤平衡柱体，取硫酸铵分级沉淀后的兔抗血清0.77 mL，过0.45 μm 水系滤膜，将多抗缓慢加入柱子内，充分混合；（2）洗涤和洗脱，用平衡缓冲液洗脱未结合的蛋白，自然流出，待非特异性洗脱至基线，用洗脱液特异性洗脱，同样自然流出，收集洗脱液。由于较低pH 值会破坏抗体活性，因此加入少量中和缓冲液用于保护抗体；（3）柱子的再生，用再生A、B 液循环3 次洗涤，再用PBS 平衡缓冲液洗涤平衡（洗涤均5 倍柱床体积）。

1.3.3 纯化前、后抗血清的纯度鉴定 对原血清、硫酸铵沉淀后的血清和免疫亲和层析后的血清样品纯度分析，将血清上样质量浓度调至2 mg/mL，参照文献[15]配置蛋白电泳胶。取出凝胶室温染色3 h，脱色液脱色后用Tanon 2500 凝胶成像仪分析。

1.3.4 纯化后抗体的效价测定 酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种快速，高度灵敏且特异的血清学检测方法[16]。参照文献[17]的方法进行间接ELISA 测定抗血清效价，设置试验所需的孔板数，CBS（碳酸盐缓冲液pH 9.6，0.05 mol/L）将大豆球蛋白稀释为2.5 μg/mL，4 ℃包被过夜，100 μL/孔，用PBST 洗板，拍干、37 ℃封闭（1% BSA）2 h，洗板，拍干、一抗为洗脱峰收集液与穿透峰收集液依次倍比稀释，孵育1 h，洗板，拍干、加酶标二抗（1∶5 000 倍稀释），100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，洗板，拍干、避光显色15 min、加入50 μL/孔H2SO4终止反应；酶标仪测定每孔OD450值。

1.3.5 间接竞争ELISA 测定纯化前、后抗体特异性 参考文献[18]的方法进行纯化前、后抗体特异性的鉴定，通过分析原血清、硫酸铵初步纯化血清、硫酸铵初步纯化再过柱3 种血清进行特异性对比，分析半数抑制率IC50（抗血清的敏感性）和交叉反应率（CR）的变化情况。

2 结果与分析

2.1 免疫亲和层析柱的柱容量测定

溶胀后的CNBr-activated Sepharose 4B 与0.5 mL 质量浓度为17.7 mg/mL 的大豆球蛋白偶联反应结束后，用至少5 倍于凝胶体积偶联液洗涤未偶联蛋白，至检测洗出液的OD280＜0.02。收集全部的洗涤液用超微量核酸蛋白检测仪检测洗涤出的蛋白15 mL 质量浓度为0.025 mg/mL，因此偶联在凝胶上的大豆球蛋白约为8.48 mg，即偶联率达96%。

2.2 免疫亲和层析结果

硫酸铵沉淀后的多抗血清进入亲和柱时，与亲和柱上连接的大豆球蛋白配基结合，不与大豆球蛋白抗原特异性结合的杂蛋白被洗掉，即为图1中的穿透峰。由于本试验中上样浓度较高，样品自然流下（未施加压力），因此，亲和层析图谱上穿透峰较高、较宽，经核酸蛋白定量检测仪测定蛋白含量为4.08 mg/mL。当用pH 2.7 的洗脱液洗脱时，得到图中标注的洗脱峰，得到目标抗体6 mL，经质量浓度测定为0.3 mg/mL 的目标抗体。图中未标注的峰为操作过程中的气泡峰。

图1 抗血清过柱纯化图Fig.1 Antiserum purification column

2.3 纯化前、后大豆球蛋白特异性抗体SDSPAGE

IgG 抗体是由一条重链和一条轻链构成，显示为两条蛋白条带，由图2可以看出，未经任何处理的血清含有较多的杂蛋白（泳道1），经硫酸铵分级沉淀后（泳道2），血清纯度得到提高，大部分杂蛋白被除去，但仍含有少量的杂蛋白。4 泳道为杂蛋白，除含有部分非抗体蛋白外，可以看出杂蛋白中还含有部分非抗大豆球蛋白目标抗体。将硫酸铵分级沉淀后的抗体过柱纯化后（泳道3），泳道中已基本不含杂蛋白，因此，得到高纯度的抗大豆球蛋白目标抗体。

图2 抗血清纯化前、后SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE before and after purification of antiserum

2.4 免疫亲和层析抗体的间接ELISA 检测

对穿透峰（非特异性洗脱）和洗脱峰（特异性洗脱）收集液进行间接ELISA 测定：结果见表1，由表1可知洗脱峰中的大部分为抗大豆球蛋白目标抗体，洗脱峰收集液稀释至128 倍后间接ELISA 结果显示为阳性，穿透峰收集液（杂蛋白）稀释两倍之后即为阴性，结果表明大部分的杂蛋白和非目标抗体基本被去除，免疫亲和层析成功洗脱出大豆球蛋白特异性抗体。

表1 抗血清过柱非特异性洗脱与特异性洗脱的ELISA 鉴定Table 1 ELISA identification of non-specific elution and specific elution of antiserum by column

2.5 免疫亲和层析前、后抗体特异性鉴定结果

由表2可以看出，纯化前、后抗血清的敏感性变化不大，过柱后的抗血清敏感性最好，抗血清在过柱纯化后与花生分离蛋白基本不存在交叉反应，芝麻蛋白与纯化前、后的抗血清都无交叉反应，在纯化前，抗血清与β-伴大豆球蛋白的交叉反应率（CR）为8.6%，经硫酸铵分级沉淀后CR 有所降低，经过柱后的抗血清CR 为0.5%，这可能与偶联到柱填料上的蛋白的纯度有关（会含有少量的β-伴大豆球蛋白），结果表明，试验得到了特异性好的抗大豆球蛋白目标抗体。

表2 抗血清纯化前、后特异性鉴定Table 2 Specific identification of antiserum before and after purification

3 结论

本试验抗血清在经过硫酸铵初步纯化后与免疫亲和层析柱偶联来制备免疫亲和柱，利用抗原抗体相互作用对多抗血清纯化并进行免疫学特性鉴定。制备抗大豆球蛋白抗体时，除含有特异性抗体外,还有球蛋白等杂质,因此对动物免疫血清纯化是必要的[19]。硫酸铵分级沉淀会除去杂蛋白，但去除不完全，仅为初步纯化，因此通过SDSPAGE 所呈现出来的电泳图会含有较多的杂蛋白以及非抗大豆球蛋白抗体，抗体经过柱纯化后，经检测，纯度得到很大提高。将过柱所得到的非特异性洗脱液和特异性洗脱液进行间接ELISA 试验，非特异性洗脱液（杂蛋白）中所含的抗体基本不与孔板中所包被的大豆球蛋白结合而呈阳性反应，特异性洗脱的抗体在经128 倍稀释后与大豆球蛋白仍呈阳性反应。间接竞争ELISA 对抗血清特异性鉴定结果显示，抗血清与β-伴大豆球蛋白的交叉反应率很低，试验成功获得了纯度高、敏感性好、特异性强的抗大豆球蛋白目标抗体。