沉默MAGI2基因对乳癌耐药细胞增殖与凋亡影响

李一,黄婷,杨麟瀚,吴池华

(四川省人民医院(四川省医学科学院)乳腺外科,四川 成都 610072)

乳癌是女性肿瘤中死亡率较高的癌症之一,目前临床上常采用手术切除、放化疗等治疗手段,但是仍会出现治疗效果不佳、复发等不良情况[1-2]。阿霉素是化疗常用的治疗药物之一,在化疗过程中容易产生耐药性,严重影响病人的治疗效果[3-6]。研究结果显示,膜相关鸟苷酸激酶转化蛋白2(MAGI2)可通过结合于第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)从而调控肿瘤细胞增殖、凋亡等[7]。MAGI2被证实在乳癌细胞中发挥重要的调控作用,但对乳癌耐药细胞的研究相对较少。因此,本实验通过检测MAGI2在人乳癌细胞MCF-7及阿霉素耐药细胞MCF-7/ADR 中的表达量,并通过小干扰RNA(siRNA)下调其MCF-7/ADR 细胞中的表达量,观察其对细胞增殖、凋亡的影响,为提高乳癌耐药细胞的分子靶向治疗效果提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人乳癌细胞MCF-7购自美国模式菌种收集中心,胎牛血清购自美国HyClone公司,DMEM 培养基购自美国Gibco公司,Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司,细胞计数试剂盒(CCK-8)购自日本DOJINDO 公司;流式细胞术检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司,siRNA NC质粒、siRNA MAGI2质粒购自上海吉玛制药技术有限公司,兔抗MAGI2、兔抗磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、兔抗丝苏氨酸蛋白激酶(AKT)抗体、兔抗磷酸化PI3K(p-PI3K)、兔抗磷酸化AKT(p-AKT)、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)购自美国Abcam 公司。流式细胞仪、酶标仪购自美国BD 公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 MCF-7及MCF-7/ADR 细胞置于DMEM 培养基中孵育,加入体积分数0.10胎牛血清。为维持MCF-7/ADR 细胞的耐药性,额外在培养基中加入75 mg/L 阿霉素。培养条件为体积分数0.05 CO2、37 ℃,每2 d更换1次培养基,加入胰蛋白酶按1∶3比例传代。

1.2.2细胞转染 选取对数期的MCF-7/ADR 细胞,将其随机分为si-NC 组、si-MAGI2组。si-NC组和si-MAGI2组根据Lipofectamine 2000说明书将siRNA NC 质粒和siRNAMAGI2质粒分别转染入MCF-7/ADR 细胞,继续培养48 h。

1.2.3qPCR 实验 按照TRIzol试剂盒说明书提取各组细胞的总RNA,并检测其浓度和纯度,采用逆转录试剂盒合成c DNA,最后进行PCR 扩增。以GAPDH 作为内参照,通过Bio-Rad PCR 系统分析MAGI2的表达水平。所用引物及其序列见表1。

表1 qPCR 引物及其序列

1.2.4CCK-8实验 收集1×105个MCF-7/ADR细胞,根据1.2.2的方法进行转染,培养48 h,接种至96孔板,分别培养24、48、72 h,每孔加入10μL的CCK-8工作液,孵育2～3 h,在酶标仪490 nm 波长处检测吸光度值(A 值)。

1.2.5蛋白质印迹法(Western blot)实验 收集MCF-7/ADR 细胞,加入RIPA 裂解液(含10 g/L的PMSF),4 ℃孵育30 min,提取细胞总蛋白,与适量缓冲液混匀,100 ℃变性10 min。吸取20μg蛋白依次加入上样孔,通过100 g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,将目的蛋白转移至PVDF膜上,放置50 g/L 封闭液孵育1 h,将PVDF 膜转移至装有加入MAGI2抗体(1∶1 000)、PI3K(1∶2 000)、AKT(1∶10 000)、p-PI3K(1∶5 000)、p-AKT(1∶1 000)溶液中,4 ℃过夜,加入二抗(1∶5 000)孵育60 min,显影、曝光,比较MAGI2 和GAPDH 蛋白灰度值比值。

1.2.6流式细胞术实验 收集MCF-7/ADR 细胞,加200μL 磷脂酰结合蛋白V-FITC/碘化丙啶工作液,37 ℃孵育15 min,流式细胞仪检测其凋亡率。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0统计学软件进行分析。计量资料结果以表示,两组均数比较采用t检验。以P＜0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 MAGI2 在MCF-7及MCF-7/ADR 细胞表达

MAGI2在MCF-7 和MCF-7/ADR 细胞中的表达量分别为1.000±0.075 和2.136±0.118。与MCF-7细胞相比,MAGI2在MCF-7/ADR 细胞中的表达量增加,差异具有统计学意义(t=19.902,P＜0.05)。见图1。

图1 MAGI2 在MCF-7以及MCF-7/ADR细胞中表达比较

2.2 沉默MAGI2 对MCF-7/ADR 细胞MAGI2蛋白表达和细胞增殖影响

与si-NC 组相比,si-MAGI2组MCF-7/ADR细胞中MAGI2蛋白表达量明显降低,差异有显著性(t=20.175,P＜0.05);si-MAGI2组MCF-7/ADR 细胞增殖明显抑制,差异具有统计学意义(t=2.129～6.167,P＜0.05)。见图2、表2。

表2 沉默MAGI2 对MCF-7/ADR 细胞增殖的影响(n=6,)

表2 沉默MAGI2 对MCF-7/ADR 细胞增殖的影响(n=6,)

与si-NC组相比,*t=2.129～20.175,P＜0.05。

图2 转染后MCF-7/ADR细胞中MAGI2蛋白表达量

2.3 沉默MAGI2 对MCF-7/ADR 细胞凋亡影响

si-NC组和si-MAGI2组MCF-7/ADR 细胞的凋亡率分别为(5.236±0.479)% 和(27.423±2.152)%。与si-NC 组相比,沉默MAGI2可促进MCF-7/ADR 细胞凋亡,差异具有统计学意义(t=24.651,P＜0.05)。

2.4 沉默MAGI2 对PI3K/AKT 信号通路相关蛋白表达影响

结果显示,与si-NC 组相比,沉默MAGI2对MCF-7/ADR 细胞中总PI3K 蛋白水平及总AKT蛋白水平均无明显影响,但可明显降低p-PI3K 蛋白和p-AKT 蛋白的表达量,差异具有统计学意义(t=18.266、19.117,P＜0.05)。见图3、表3。

图3 沉默MAGI2 对PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达影响

表3 沉默MAGI2 对PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达影响(n=6,)

表3 沉默MAGI2 对PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达影响(n=6,)

与si-NC组相比,*t=18.266、19.117,P＜0.05。

3 讨 论

乳癌是一种女性常见恶性肿瘤[8-9]。化疗是一种常用的乳癌治疗手段,其中阿霉素是临床常用的化疗药物[10-11]。MAGI2是膜相关鸟苷酸激酶家族的成员之一,含有1 227个氨基酸残基,具有多个结构域,能够与相应的配体结合从而参与细胞的增殖、凋亡等过程。近年来的研究证实,MAGI2参与多种癌症的发生发展过程。例如,MAGI2在胰腺癌组织中表达量异常,与临床病理特征如分期、复发等相关[12]。有研究表明,MAGI2可作为miR-487a的靶基因参与乳癌细胞的侵袭、迁移、上皮细胞间充质转化等过程,在乳癌组织生长以及转移过程中发挥重要的调控作用[13],这说明MAGI2可以作为乳癌临床诊断的潜在标志物。本研究结果显示,MAGI2蛋白在MCF-7/ADR 细胞中较MCF-7 表达量上调,而下调MAGI2蛋白表达水平可抑制MCF-7/ADR细胞增殖、诱导其凋亡,表明MAGI2可通过促进乳癌细胞增殖并抑制其凋亡,增强其阿霉素耐药性。

研究表明,MAGI2 含有与PTEN 蛋白具有高亲和力的结构域,通过特异性募集、结合于PTEN,促进PTEN 蛋白的稳定性表达[7],PTEN 可参与多种肿瘤的发生与发展,例如前列腺癌、口腔癌、乳癌等[14-16]。PTEN 主要通过影响PI3K/AKT 等信号通路的活性,参与肿瘤细胞的生物学特性[17-20]。研究显示,PI3K/AKT 可以参与多种肿瘤细胞的增殖、凋亡等[21-22],影响多种肿瘤的病理进展过程,如卵巢癌、结肠癌、乳癌等[23-24],与乳癌、非小细胞肺癌等肿瘤的耐药性密切相关[25-28]。LI等[25]研究结果显示,si-HOTAIR通过抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路的表达降低乳癌细胞对阿霉素的抗性。本文研究结果显示,下调MAGI2对总的PI3K 蛋白、AKT 蛋白水平均无显著的影响,但可明显降低p-PI3K 蛋白、p-AKT 蛋白水平,表明下调MAGI2可能是通过特异性结合于PTEN,进而影响PI3K/AKT 信号通路的活化水平,从而调控乳癌细胞的耐药性。

综上所述,MAGI2基因在乳癌阿霉素耐药细胞MCF-7/ADR 中表达量增加;下调MAGI2基因可能通过影响PI3K/AKT 信号通路相关蛋白的活性水平,从而抑制耐药细胞增殖,诱导其凋亡,这为耐药细胞的分子靶向治疗提供理论依据。未来会进一步在多株耐药细胞系、动物模型以及临床样本中进一步探究MAGI2调控乳癌细胞耐药性的作用以及机制。