多种血清肿瘤相关抗原自身抗体联合检测对骨肉瘤的诊断价值研究

罗漫丽，黄满玉，李东升，马言，张勇勇，罗亚鸽，李记天，代丽萍

(1.郑州大学基础医学院，河南 郑州 450001；2.河南省洛阳正骨医院/河南省骨科医院，河南 郑州 450016)

骨肉瘤是10～20岁青少年最常发生的骨肿瘤[1]，恶性度极高，预后较差[2]。骨肉瘤的高致残率和死亡率在一定程度上可归因于缺乏有效的早期诊断手段。肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)抗体系统已被证实对多种肿瘤具有良好的诊断效能[3-7]。TAA自身抗体的含量在癌变早期就已经增加[8]，即使抗原含量很低[9]，甚至已经被清除[10]，对应自身抗体的含量依然很高且稳定[11]。但单个TAA自身抗体诊断骨肉瘤的准确性较差。为此，本研究依据前期研究结果，拟从抗烯醇化酶1(enolase 1，ENO1)自身抗体、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)自身抗体、抗热休克蛋白(heat shock protein，HSP)27自身抗体、抗HSP60自身抗体、抗核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin 1，NPM1)自身抗体、抗人PDZ和LIM域蛋白1(PDZ and LIM domain 1，PDLIM1)自身抗体、抗重组人微管解聚蛋白1(stathmin 1，STMN1)自身抗体和抗丙糖磷酸异构酶1(triosephosphate isomerase 1，TPI1)自身抗体共8种血清TAA自身抗体中筛选一组TAA自身抗体组合，联合检测以提高早期诊断骨肉瘤的准确率，现总结报告如下。

1 临床资料

受试对象为2013年12月至2016年6月在河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)骨肿瘤科门诊就诊或住院治疗的骨肉瘤患者(骨肉瘤组)，以及同时期在医院体检的健康志愿者(健康组)。骨肉瘤组51例，男33例、女18例。年龄4～64岁，中位数20岁。所有骨肉瘤患者均结合临床表现、影像学及病理学检查结果确诊。患者就诊前未针对骨肉瘤进行放射治疗、化学药物治疗及手术治疗；均不合并其他原发肿瘤及肝、肾、免疫系统疾病。健康组51例，男33例、女18例。年龄5～59岁，中位数25岁。试验方案经医院医学伦理委员会审查通过。

2 方 法

2.1 标本收集与处理试验所用血清为受试对象就诊或体检时保存的血清样本。清晨空腹状态下采集外周血，标本收集后30 min内以3000 r·min-1离心10 min(离心半径10 cm)，提取血清，置于-80 ℃冰箱保存。此次试验抗体检测前，于4 ℃冰箱中缓慢解冻，避免反复冻融。

2.2 血清TAA自身抗体含量检测使用间接ELISA法检测所有受试对象血清中抗ENO1自身抗体、抗GAPDH自身抗体、抗HSP27自身抗体、抗HSP60自身抗体、抗NPM1自身抗体、抗PDLIM1自身抗体、抗STMN1自身抗体、抗TPI1自身抗体等8种TAA自身抗体的含量。将各抗原用包被液稀释到1.0 μg·mL-1，每孔100 μL包被到酶标板上，4 ℃孵育过夜。吸弃酶标板中的包被液，每孔加入2%牛血清蛋白200 μL，在室温下封闭2 h。弃掉板中液体，以PBST(PBS中加入0.05%的Tween 20)洗板3次。将研究对象的血清按1∶100的比例稀释，每孔100 μL包被在酶标板上，37 ℃半水浴孵育1 h，同时加入阴性和阳性血清作为对照，空白对照孔中加入抗体稀释液。PBST洗板5次，拍干。以辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(H+L)作为二抗(1∶4000稀释)，37 ℃半水浴孵育1 h，再用PBST洗板5次。检测试剂采用EL-ABTS显色试剂盒，显色液每孔100 μL，避光条件下37 ℃水浴15 min后加入终止液50 μL，使用全长酶标仪检测405 nm处的光密度值(OD值)。每种自身抗体检测2次，最终结果取平均值。

2.3 血清TAA自身抗体含量检测诊断骨肉瘤的结果评价按单侧估计各TAA自身抗体含量的95%参考值范围，≥参考值即判定为骨肉瘤，以此计算和评价各TAA自身抗体血清含量检测诊断骨肉瘤的价值。按诊断的灵敏度由高到低排序，从灵敏度最高的自身抗体开始，每次增加1种灵敏度排名次一位的自身抗体，计算和评价对应的TAA自身抗体联合检测诊断骨肉瘤的价值。

2.4 数据统计采用SPSS21.0软件进行数据统计分析，2组受试对象血清TAA自身抗体含量的组间比较均采用Mann-Whitney U检验，检验水准α=0.05。

3 结 果

3.1 血清TAA自身抗体含量检测结果2组受试对象血清中抗ENO1自身抗体、抗GAPDH自身抗体、抗HSP27自身抗体、抗HSP60自身抗体、抗PDLIM1自身抗体、抗STMN1自身抗体和抗TPI1自身抗体含量比较，组间差异均有统计学意义；2组受试对象血清中抗NPM1自身抗体含量比较，差异无统计学意义(表1)。

表1 2组受试对象8种肿瘤相关抗原自身抗体血清含量

3.2 血清TAA自身抗体含量检测诊断骨肉瘤的结果除抗NPM1自身抗体之外的7种TAA自身抗体中，抗STMN1自身抗体诊断骨肉瘤的价值最大，其灵敏度为27.45%、特异度为96.08%、Youden指数为0.2353、Kappa值为0.24(表2)。随着联合检测的TAA自身抗体种类增加，诊断的灵敏度逐渐增大、特异度逐渐减小，当联合检测抗STMN1自身抗体、抗TPI1自身抗体、抗PDLIM1自身抗体、抗ENO1自身抗体和抗HSP27自身抗体5种血清TAA自身抗体时，诊断效果比较理想，对应的灵敏度为60.78%、特异度为80.39%、Youden指数为0.411 8、符合率为70.59%、Kappa值为0.41(表3)。

表2 7种肿瘤相关抗原自身抗体血清含量检测诊断骨肉瘤的结果

表3 多种肿瘤相关抗原自身抗体血清含量联合检测诊断骨肉瘤的结果

4 讨 论

由于骨肉瘤具有较高的致残率和死亡率，因此早期诊断非常重要[12]。自身抗体作为一种自身免疫现象已经在许多研究中被应用，可作为疾病早期筛查的一种有效手段[13-14]。根据前期研究结果，本研究采用间接ELISA法检测抗ENO1自身抗体、抗GAPDH自身抗体、抗HSP27自身抗体、抗HSP60自身抗体、抗PDLIM1自身抗体、抗STMN1自身抗体、抗TPI1自身抗体和抗NPM1自身抗体的血清含量。其中前7种解聚蛋白1；7)丙糖磷酸异构酶1。

TAA自身抗体的血清含量在骨肉瘤组和健康组之间的差异有统计学意义。然而，单一的TAA自身抗体诊断骨肉瘤的价值有限。基于此，本研究对各TAA自身抗体联合检测诊断骨肉瘤的效果进行了评价，当联合检测抗STMN1自身抗体、抗TPI1自身抗体、抗PDLIM1自身抗体、抗ENO1自身抗体和抗HSP27自身抗体等5种血清TAA自身抗体时的诊断效果较为理想，对应的灵敏度为60.78%、特异度为80.39%、Youden指数为0.4118、符合率为70.59%、Kappa值为0.41。

STMN1作为一种在多种肿瘤中均存在的胞浆磷蛋白，其在骨肉瘤组织中的含量可用于判断骨肉瘤的预后[15]。Chen等[16]的研究发现，包含TPI1和ENO1基因的一组标志物可以诊断骨肉瘤。一项关于PDLIM1自身抗体和乳腺癌的研究表明，高滴度的抗PDLIM1自身抗体在乳腺癌病例组中显著高于对照组[17]。Moon等[18]的研究表明，HSP27可作为鉴别常规骨肉瘤与低级别中心型骨肉瘤的标志物，也可作为骨肉瘤的一个潜在预后标志物。

Gao等[19]的研究表明，通过几种循环miRNAs的组合诊断骨肉瘤具有较高的准确性，其灵敏度、特异度和ROC曲线下面积(area under curve，AUC)分别为79%、89%和0.90，但循环miRNAs的检测对样本的处理要求较高。截至目前，尚未见到应用自身抗体组合早期诊断骨肉瘤的研究报道。但在针对其他类型肿瘤的研究中，联合检测自身抗体被证明具有较高的诊断价值。Wang等[20]找到了9种自身抗体(V-Ral猴白血病病毒癌基因同源物A、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2、肿瘤抑制蛋白53、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3、蛋白磷酸酶2A癌抑制因子、细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子、癌基因c-Myc结合蛋白、α2-HS糖蛋白、14-3-3蛋白zeta)作为诊断卵巢癌的最佳组合，其灵敏度和特异度分别为61.4%和85.0%，当结合临床上常用的糖类抗原125时，其灵敏度、特异度和AUC分别达到94.7%、78.2%和0.914。Zhang等[21]选择了一组包括4种抗体的组合，这个组合在诊断食管癌的训练集中的AUC为0.838、在验证集中AUC为0.872，具有较高的诊断效能。Wang等[22]的研究发现，胰岛素样生长因子 2 mRNA 结合蛋白2、癌基因c-Myc结合蛋白、核仁磷酸蛋白1、14-3-3蛋白zeta、鼠双微体2蛋白和细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子等6种自身抗体的组合对胃癌尤其是早期胃癌具有较高的诊断价值，在训练集中AUC为0.841、在验证集中AUC为0.856。基于这些研究，早期使用自身抗体的组合来诊断骨肉瘤是完全可行的。

本研究的结果提示，联合检测抗STMN1自身抗体、抗TPI1自身抗体、抗PDLIM1自身抗体、抗ENO1自身抗体和抗HSP27自身抗体5种血清TAA自身抗体，对骨肉瘤具有较高的诊断价值。本研究的局限性在于纳入的骨肉瘤患者较少，今后应增加样本以进一步验证该诊断方案的可靠性。