腹泻患者艰难梭菌检测与分析

杨明，牛敏

（1.云南省曲靖市富源县人民医院 检验科，云南 富源 655500；2.昆明医科大学第一附属医院 检验科，云南 昆明 650032）

0 引言

艰难梭菌（Clostridium difficile，CD）为革兰阳性芽孢杆菌，属于严格的厌氧菌，对环境抵抗力较弱，对氧极度敏感，在空气中极易死亡。可定植于肠道，属于条件致病菌，正常情况下不致病，当大量使用抗菌药物，肠道环境遭到破坏，受抑制的CD大量繁殖，所产生的毒素可引起抗生素相关性腹泻（antibiotic-associated diarrhea，AAD）。CD主要产生艰难梭菌A毒素（ clostridiaum difficile toxin A，TcdA）和（或）B毒素（ clostridium difficile toxin B，TcdB）致病，TcdA为肠毒素，可与肠黏膜受体结合，引起局部肠黏膜血管的通透性增加，致绒毛损害，黏膜出血、坏死；TcdB是一种高致病的细胞毒素，能解聚肠黏膜肌动蛋白，破坏细胞骨架，对肠道产生更大的破坏[1]。轻者可引起腹泻，严重者发展为伪膜性肠炎甚至死亡。

谷氨酸脱氢酶（GDH）是CD的一种膜蛋白，产毒株和非产毒株均含有该蛋白，与艰难梭菌是否产生毒素无关，稳定性好，在各种类型CD中都具有高保守性和低突变率[2]。由于CD的培养条件要求高，许多医院无法开展，对艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）的诊断遇到极大的困难。目前认为粪便GDH和毒素A/B检测是CDI的一种有效的筛选试验，为了了解本院住院患者艰难梭菌的感染情况，本研究对住院腹泻患者粪便标本采用酶联免疫荧光法进行艰难梭菌GDH和毒素A/B的检测，为诊断CDI提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源。收集2019年10月至2020年1月昆明医科大学第一附属医院住院腹泻患者粪便标本62例。其中，男性患者41例，女性患者21例，患者在住院期间均使用过抗菌药物治疗且发生过腹泻，抗菌药物使用时间最短3 d，最长20 d。粪便标本均采用一次性使用采样杯收集。

1.2 主要仪器和试剂。mini VIDAS荧光免疫分析仪（法国生物梅里埃公司），艰难梭菌谷氨酸脱羧酶（GDH）检测试剂盒（酶联免疫荧光法）和艰难梭菌毒素A/B检测试剂盒（酶联免疫荧光法）均由法国生物梅里埃公司生产，一次性使用采样杯（浙江拱东医疗器械股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 谷氨酸脱羧酶（glutamate dehydrogenase，GDH）检测：艰难梭菌谷氨酸脱羧酶（GDH）检测试剂盒（酶联免疫荧光法）采用两步酶免夹心法与终点荧光检测相结合的技术，检测标本中GDH含量，荧光强度随标本中GDH含量的增加而增强。严格按照说明书操作，稀便取200 mg加入200 μL蒸馏水中稀释混匀备用，用移液器将水样便反复抽吸混匀备用。然后将混匀好的200 μL液体粪便加入一清洁离心管内。使用带有一次性枪头的移液器，并将1000 μL的预处理试剂（R1艰难梭菌）加入离心管内，再次用移液器反复抽吸混匀。利用涡旋振荡器充分混合标本，确定标本与预处理试剂（R1艰难梭菌）彻底混匀。在2℃～25℃环境中，以3000 g离心10 min，使用带有一次性枪头的移液器取300 μL上清液用于上机检测。50 min检测完毕后仪器会自动分析结果，生成检测值，并打印报告单。检验结果：荧光值＜0.10为阴性，荧光值≥0.10为阳性。

1.3.2 毒素A/B（TcdA/B）检测：艰难梭菌毒素A/B检测试剂盒（酶联免疫荧光法）采用两步酶免夹心法与终点荧光检测相结合的技术，检测标本中毒素A/B抗原，荧光强度随标本中毒素A和B含量的升高而升高。严格按照说明书操作，稀便取200 mg加入200 μL蒸馏水中稀释混匀备用，用移液器将水样便反复抽吸混匀备用。然后将混匀好的200 μL液体粪便加入一清洁离心管内。使用带有一次性枪头的移液器，并将1000 μL标本稀释液（R1）加入离心管内，再次用移液器反复抽吸混匀。利用涡旋振荡器充分混合标本，确定标本与标本稀释液（R1）彻底混匀。在2℃～25℃环境中，以12000 r离心5 min，使用带有一次性枪头的移液器取300 μL上清液用于上机检测。75 min检测完毕后仪器会自动分析结果，生成检测值，并打印报告单。检验结果：荧光值＜0.13为阴性，0.13≤荧光值＜0.37为可疑，荧光值≥0.37为阳性。

2 结果

2.1 艰难梭菌GDH检测。收集的62例粪便标本中，GDH阳性17例，阳性率为27.4%（17/62）；17例GDH阳性标本中男性13例占76.5%（13/17），女性4例占23.5%（4/17）。未定型结肠炎患者的CD感染率41.2%（7/17）最高，使用氟喹诺酮类抗菌药物治疗的患者CD感染率41.2%（7/17）也是最高。

2.2 艰难梭菌毒素A/B检测。17例GDH阳性标本中艰难梭菌毒素A/B阳性5例，阳性率为29.4%（5/17）。其中男性4例，占80%（4/5），女性1例，占20%（1/5）；可疑6例，占35.3%（6/17）。艰难梭菌毒素A/B的检出率为8.1%（5/62）。5例GDH和毒素A/B均阳性标本临床相关疾病见表1，抗菌药物使用情况见表2。

表1 5例GDH和毒素A/B均阳性标本临床相关疾病

表2 5例GDH和毒素A/B均阳性标本抗菌药物使用情况

2.3 其他检验。5例GDH和毒素A/B阳性患者：外周血白细胞计数和超敏C反应蛋白均升高；粪便常规白细胞和潜血均为阳性。

3 讨论

随着抗菌药物的广泛使用、CD经多种途径传播及高毒性菌株的出现导致CDI的发病率和病死率不断增高。近年来，CD已成为引起院内感染腹泻和肠炎的主要病原体，由于过度使用抗菌药物，我国CDI逐年上升，在一篇荟萃分析中显示，我国2009-2015年住院腹泻患者艰难梭菌感染率是19%，不同国家和不同地区的感染率不同[3]。患者使用抗菌药物后肠道菌群遭到严重破坏，肠道菌群不能有效抑制CD的生长，受抑制的CD大量繁殖，可引起腹泻，严重者发展为抗生素相关性腹泻、抗生素相关性结肠炎、伪膜性肠炎甚至死亡。CD引起的感染短期内很难控制，治疗时间相对较长。所以提高腹泻患者早期粪便CD检测对于CDI的确诊和对症治疗及预防有重要意义。

CD的检测方法主要有厌氧培养、酶联免疫法、核苷酸扩增检测等。培养法、核苷酸扩增检测都需要特殊的仪器设备、有经验的技术人员、花费时间较长、操作比较繁琐、不易推广[4]。目前检测CDI最常推荐的方法是两步法，第一步通过酶联免疫荧光法检测GDH进行初筛；第二步对GDH阳性标本进行毒素检测确诊。酶联免疫荧光法测定艰难梭菌GDH和毒素A/B具有灵敏度高，检测周期短，操作简单，在临床实验室易于开展等优点。GDH是CD表面大量存在的保守抗原，其稳定性和灵敏度较高，最大优势在于有很高的阴性预测值，通过查阅多篇文献发现，GDH检测阴性预测值高达90%以上，这提示GDH检测阴性的患者CDI的可能性极低，GDH阴性样本可排除CDI，GDH阳性标本再进行毒素测试来确定。GDH联合毒素AB检测有助于CDI患者的诊断。上述方法CDI判断标准为：GDH与毒素A/B均阳性确认为CDI；GDH与毒素A/B均阴性排除CDI；GDH阳性、毒素A/B阴性需用毒力生成培养试验（toxigenic culture，TGC）或核苷酸扩增检测方法进行二次确认检测。

本次采集的住院患者62例粪便标本中，GDH阳性17例，阳性率为27.4%（17/62），高于相关文献报道的20.9%（34/163）[5]；毒素A/B的检出率为8.1%（5/62），与国内同类研究检出率8.6%（6/70）[6]较为一致。17例GDH阳性标本中艰难梭菌毒素A/B阳性5例，阳性率为29.4%（5/17），低于于相关文献报道的41.2%（14/34）[5]；可疑6例，占35.3%（6/17）。由于实验条件限制，本研究未对6份可疑阳性标本进行TGC或核苷酸扩增检测是否为产毒菌株，如果是产毒菌株将提高了本研究中艰难梭菌和毒素A/B检出的阳性率。本研究中检测标本例数较少，可能是造成阳性率较低的主要原因之一。5例阳性患者同时存在外周血白细胞计数、超敏C反应蛋白不同程度升高，粪便常规白细胞和潜血试验均为阳性，这些结果均支持CDI的诊断。溃疡性结肠炎患者CDI感染率高，这与本团队前期研究结果相符[7]；抗菌药物使用情况显示使用氟喹诺酮类药物治疗的患者CDI感染率明显高于使用其他药物治疗的患者，与国内相关文献报道一致[8]；男性感染率明显高于女性，提示性别可能是CDI的一个危险因素，与一篇荟萃分析相吻合[3]。住院患者GDH检出率较高，提示我院CD的携带者或感染者较高，需要加强对重点人群CDI的筛查与防控。GDH检出阳性率较高，毒素A/B检出阳性率较低，提示我们应采用多种方法进行毒素A/B的检测，以提高CDI确诊的阳性率。随着CDI患者的不断增加，CDI问题引起广泛关注。为预防控制出现CDI的持续上升，首先医院通过采用手部卫生护理、接触防护、环境清洁和消毒等措施进行有效预防，其次临床中严格规范应用抗菌药物。同时，我们必须积极增加多种CD的检测方法，提高CD的检出率，为CDI的早期诊断、有效治疗和感染防控提供依据。