清热凉血方对血热型银屑病外周血CD4+T细胞表面TIGIT表达的影响

王菲菲，张雪松，白彦萍

（1.北京中医医院顺义医院，北京 101300；2.中日友好医院，北京 100029）

银屑病，中医称之为“白疕”，临床主要特征为红斑、鳞屑，且伴有不同程度的瘙痒[1]。目前，银屑病被认为是一种免疫细胞功能异常所引起的炎症性皮肤病。免疫细胞尤其是CD4+T 淋巴细胞功能异常在银屑病发病过程中起到重要作用[2]。TIGIT 是一种免疫毒性显著低于CTLA-4、PD-1 等的共抑制分子[3]。可通过激活CD4+T 细胞上TIGIT 信号通路，抑制CD4+T细胞增殖及功能[4-5]。临床上针对免疫靶点的探索已成为治疗银屑病的研究重点。清热凉血方是白彦萍教授在多年临床经验的基础上，研制出针对血热型银屑病的方药。课题组前期研究中发现清热凉血方可改善银屑病患者CD4+T 细胞功能[6]。因此，探究清热凉血方是否可通过干预TIGIT 表达调节银屑病患者外周血CD4+T 细胞增殖及其功能，将为银屑病的治疗提供新方法和新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择中日友好医院皮肤科门诊及病房血热型银屑病患者28 例，男14 例，女14 例，平均年龄（45.77±16.79）岁；平均病程（13.63±11.21）年，PASI评分（10.43±6.35）分。健康对照组14 例，为北京中医药大学体检健康的大学生及中日友好医院体检健康的医护工作人员，男6 例，女8 例，年龄（43.54±15.62）岁。在血热型银屑病组中选取PASI评分＞10 分的8 例患者与健康对照组中的8 例进行外周血细胞因子的比较，并对此8 例患者进行治疗干预以及前后对比。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断符合中华医学会皮肤性病分会银屑病学组制定的《中国银屑病治疗专家共识（2014 版）》。中医辨证诊断符合《寻常型银屑病中医外治特色疗法专家共识（2017 年）》中“血热证”的诊断标准，主症：瘙痒，鳞屑，红斑；次症：心烦易怒，口干口渴，大便燥结，小便黄；舌脉：舌质红或绛，苔黄，脉滑或弦数。

1.2.2 病情严重程度判断 依据国际通用的银屑病面积和严重程度指数（psoriasis area and severity index,PASI）标准，包括皮损面积评分和皮损严重程度评分。

1.3 纳入标准 1）18～65 周岁确诊为血热型银屑病患者；2）初发未经治疗者；3）4 周内未接受系统治疗者；4）签署知情同意书者。

1.4 排除标准 1）严重感染、创伤等应激状态者；2）妊娠期及哺乳期患者；3）合并有自身免疫性疾病、循环系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统、内分泌系统和造血系统等严重原发性疾病、常规用药无法控制病情的患者，合并肿瘤的患者，合并精神系统疾病且不能配合的患者。标本采集均在征得患者知情的前提下进行，并签署知情同意书，实验结束后将实验结果告知患者。

1.5 治疗方法

1.5.1 给药剂量和频率 清热凉血方方药组成：生地黄15 g，牡丹皮15 g，紫草15 g，赤芍15 g，蛇莓10 g，白英15 g，土茯苓15 g，白花蛇舌草15 g。水煎400 mL，每日1 剂，分2 次服用。上述各药物由中日友好医院制剂室调配，煎煮至400 mL并分装，每日2次，每次200 mL 口服。每次复诊时将药袋回收。

1.5.2 治疗和随访周期 治疗周期为2 个月，每2 周复诊1 次，在第2 个月对患者进行指标检测。

1.6 临床疗效评价 疗效评价标准以银屑病PASI评分为根据，由2 名未参与研究的副主任医师及以上的盲态医生对2 组治疗前后分别予以PASI评分。

1.7 血浆细胞因子检测 采用CBA 法检测患者治疗前后外周血中IFN-g、IL-17、IL-10 含量，比较治疗前后外周血中IFN-g、IL-17、IL-10 含量变化。具体检测步骤严格按试剂盒说明书进行（CBA Human Soluble Protein Flex Set，美国BD 公司）。

1.8 流式细胞仪检测TIGIT 表达 使用Focill 密度梯度离心法获取外周血单个核细胞（PBMCs）标本，将1×106PBMCs 细胞悬液定容至100 uL。分别加入3 μL Alexa Fluor®488-CD3，3 μL APC-CD4，25 μL PE-TIGIT抗体，室温避光孵育30 min；孵育结束后，在流式管中加入1 mL PBS，常温离心，1 500 r/min，5 min；每管用300 μL PBS 重悬；将重悬的细胞过滤后，上流式细胞仪检测PBMCs 中TIGIT+CD4+T 细胞的表达频率。

1.9 统计学方法 采用Excel 和SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差（）表示。组内治疗前后比较采用Wilcoxon配对检验；P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组外周血TIGIT 表达比较 TIGIT+CD4+T 细胞在银屑病患者中表达频率为（10.88±0.54）%，显著低于健康对照组的（17.29±1.11）%，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 2组外周血IFN-g、IL-10、IL-17A表达比较 见表1。

表1 2 组外周血IFN-g、IL-10、IL-17A 表达比较（，n =8） （pg/mL）

表1 2 组外周血IFN-g、IL-10、IL-17A 表达比较（，n =8） （pg/mL）

注：与健康对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.3 血热型银屑病组治疗前后PASI评分情况 患者经治疗后PASI评分为（10.62±0.40）分，较治疗前的（16.99±0.76）分显著下降，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。

2.4 血热型银屑病组治疗前后外周血TIGIT 表达情况 患者经治疗后TIGIT+CD4+T 细胞表达频数为（17.35±0.76）%，较治疗前的（12.41±0.83）%显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.5 血热型银屑病组治疗前后血浆IFN-g、IL-10、IL-17A 表达比较 见表2

表2 血热型银屑病组治疗前后血浆IFN-g、IL-10、IL-17A表达比较（，n =8） （pg/mL）

表2 血热型银屑病组治疗前后血浆IFN-g、IL-10、IL-17A表达比较（，n =8） （pg/mL）

注：与治疗前比较，## P ＜0.01

3 讨论

银屑病发病率逐年升高，目前全球患病人数将近1.25 亿，为全球性重大疑难病[7-8]。其发病机制比较公认是在多基因遗传背景下，受到环境因素的影响，有多种免疫细胞及炎症性细胞因子参与其中[9-10]。大量证据显示，免疫细胞尤其是T 淋巴细胞功能失调在本病发病过程中起到重要作用[11]。淋巴细胞和上皮细胞之间的交互作用促发并维持了银屑病的“炎症微环境”[12]。活化的淋巴细胞浸润至皮肤并释放多种细胞因子和趋化因子，如Th1 和Th17 细胞释放的IFN-g 和IL-17，可促进免疫细胞的募集、刺激角质形成细胞增殖及产生炎症因子，促使了银屑病特征性皮损的发生发展[13-14]。在淋巴细胞活化过程中除需要MHC-肽-TCR复合体给予第一信号外，第二信号即共刺激信号在后续活化及功能维持方面起重要作用[15]。共刺激分子在多种疾病如免疫性疾病、肿瘤等的发病过程中，通过影响淋巴细胞功能参与疾病的发生发展。共刺激分子根据其主要功能可分为正性共刺激分子和负性共刺激分子两类，分别对T 细胞产生刺激性及抑制性作用，其中抑制性分子的受体又称免疫检查点，可以通过与其配体特异性结合抑制T 细胞过度活化及增殖，在维持免疫稳态方面发挥关键作用。

TIGIT 是T 细胞活化和增殖过程中具有重要作用的共抑制信号[16]。在某些自身免疫性疾病中激活T 细胞TIGIT 信号通路，能够显著影响T 细胞的功能和增殖分化[17-18]。TIGIT 可以通过3 种不同方式直接或间接调节Th1/Th17 对自身抗原及前炎性因子反应发挥免疫抑制作用：1）TIGIT 可以通过直接抑制T 细胞的活化发挥作用；2）Treg 细胞表面的TIGIT 通过与APCs上的CD155 结合，诱导耐受性APCs 释放IL-10，从而发挥抑制作用；3）TIGIT 通过促进Treg 细胞释放IL-10，Fgl2，选择性地抑制Th1/Th17 功能[19]。研究[20]进一步发现，TIGIT+Treg 细胞与TIGIT-Treg 细胞相比，TIGIT+Treg细胞显示了其对Th1/Th17特有的抑制作用。研究[21]表明银屑病患者存在Treg/Th17 比例失衡，引起IL-17、IFN-g 等细胞因子释放增加，导致疾病的发生发展。因此，我们推测通过使银屑病患者CD4+T 细胞TIGIT 表达增高，可能在银屑病的治疗中具有一定的潜在价值。

银屑病发病机制复杂，且病程易反复[22-23]，属于中医药治疗的优势病种。中医倡导整体观念、重视脏腑气血辨证，“外治必本诸于内”是中医治疗皮肤病的基本原则。“血分辨证”是目前在临床上应用较为广泛也普遍被众多医家接受的银屑病辨证论治方法[24]。血分辨证主要分为血热证、血瘀证、血燥证、血虚证等。流行病学研究发现，“血热证”在所有证型中发病率最高。清热凉血方是白彦萍教授根据临床工作中所诊治的血热型银屑病发病特点和中药药理学研究进展的自拟方。本课题组在前期研究中发现，清热凉血方可以通过影响多个信号通路发挥治疗作用，但处于银屑病发病机制“上游”的TIGIT 信号通路在银屑病中的研究较少。因此，课题组从免疫学角度出发，探索TIGIT 在银屑病发病过程中的作用，结果显示TIGIT在血热型银屑病患者外周血CD4+T 细胞中呈低表达状态，并且清热凉血方在上调血热型银屑病患者CD4+T细胞表面TIGIT 表达的同时抑制IFN-g 和IL-17A 的分泌，从而发挥治疗作用。