阿魏酸对高糖受损内皮祖细胞生物学功能和分泌SOD的影响

熊 武，白 雪，肖 慧，吴玉娟，赵世情，寻 毅，兰宏伟，袁 维*

（1.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007；2.湖南中医药大学，长沙 410208）

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一种来源于骨髓的血管干细胞，因其修复内膜及促进血管新生的作用而备受关注。EPCs 能够分化为内皮细胞，并产生保护性的细胞因子和生长因子，参与内皮修复，并通过迁移、归巢到靶组织及结合到新生血管中参与血管生成[1]。自体EPCs 有望成为治疗缺血性疾病血管重建和血管修复的新选择[2]。然而糖尿病状态下，体内产生过量的自由基，导致组织氧化应激。活性氧的过度产生及氧化应激水平提高致EPCs功能受损。目前虽然干细胞疗法已被广泛研究，但基于干细胞治疗糖尿病的临床研究却相对滞后[3-4]。虽然有大量数据表明某些糖尿病药物可以改善“内皮功能障碍”[5]，但关于糖尿病患者人类内皮细胞的数据不多，给自体EPCs 治疗带来挑战。因此需要建立一种全新策略来增强内皮祖细胞的数量及功能，为成功使用自体内皮祖细胞治疗提供可能。阿魏酸（ferulic acid，FA）是中药当归的主要活性成分，具有调节血糖、抗氧化和抗炎等多种药理活性，可预防糖尿病及其并发症[6]。FA 可通过减轻氧化应激、炎症和纤维化，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，从而改善内皮功能障碍[6-7]。然而FA 对高糖受损EPCs 功能障碍的修复作用尚未报道。故本研究主要探讨FA 在体外对高糖受损EPCs 生物学功能及对分泌SOD 的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8，CK04）购自日本同仁；DMEM（SH30022.01B）、PBS缓冲液购自美国Hyclone公司；胰酶（Gibco-15050-057）、胎牛血清（10270-106）购自美国GIBCO 公司；EGM ™-2MV 培养基（CC-3162）购自美国Lonza 公司；人淋巴细胞分离液（P8610）购自北京索莱宝科技有限公司；Dil-Ac-LDL 购自上海佰晔生物科技中心；FITC-UEA-1（L-9006）、DAPI溶液（D9542）、Fibronectin（F0635）购自Sigma 公司；Anti-CD31 抗体（ab28364）、山羊抗兔 IgG（FITC，ab6717）均购于英国Abcam 公司；Matrigel 基质凝胶购自美国Becton Dickson 公司；Transwell 小室购自美国Corning公司；过超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司；阿魏酸（Ferulic acid，FA）购自上海融禾公司。

1.2 方法

1.2.1 内皮祖细胞培养 取健康足月新生儿脐带血，采用密度梯度离心法，得到单个核细胞。使用EGM ™-2MV（Lonza）培养基重悬上述细胞，将细胞浓度调至5～6×106/mL 后接种于预包被纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）的六孔板中，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。4 d 后更换培养液继续培养；以后每3～4 d 后换液1 次。细胞融合约90%则用胰酶消化按1:3 进行传代。

1.2.2 EPCs 的鉴定 采用双荧光染色法及免疫荧光细胞化学染色法等技术对培养的内皮祖细胞进行鉴定，具体方法同前[8]。

1.2.3 EPCs 分组及处理 高糖受损内皮祖细胞：EPCs用30 mmo1/L 的葡萄糖的EGM-2 培养基培养5 天。将造模成功的EPCs 分别用0、1、2、4、8、16 mg/L 的FA 进行干预，确定FA 促高糖受损EPCs 增殖的最佳浓度。另将实验分为3 组：实验组、模型对照组、正常对照组（EPCs 用普通EGM-2 培养基培养5 d）。实验组用最佳浓度的FA 处理，模型组和正常组均用等体积的PBS 处理。

1.3 FA 对高糖受损EPCs 生物学功能的影响

1.3.1 FA 处理高糖受损EPCs 最佳浓度的选择 取增殖活跃的细胞接种于96 孔板，加FA 使其终质量浓度分别为0、1、2、4、8、16 mg/L，作用24 h 后用MTT法检测细胞存活率，以确定最佳作用浓度。

1.3.2 增殖能力检测 使用胰酶消化对数期的细胞，重悬细胞并计数，按1×105个/孔接种于96 孔板；在37 ℃、5% CO2温箱中培养24 h，待细胞贴壁；取指数生长期的细胞接种到96 孔板上，配制成100 μL 的细胞悬液；将培养板在37 ℃、5% CO2的培养箱中预培养24 h；根据实验分组加入8 mg/LFA 或PBS 进行培养。将培养板在培养箱孵育24 h 后加入10 μL CCK8溶液，培养4 h。用酶标仪测定450 nm 处OD 值；本组实验同时设置对照孔，每组设定3 复孔。

1.3.3 黏附能力检测 使用胰酶消化贴壁细胞，使细胞充分脱落后离心重悬浮于500 μL 培基中并计数，然后将同等数目细胞接种于24 孔板，在 37 ℃、5% CO2培养箱中孵育1 h 后，分别用8 mg/L FA 和PBS液干预，培养8 h 后，将同等数目的EPCs 接种在包被有大鼠纤维连接蛋白培养板中，随后在37 ℃下培养30 min，在2 个随机200 倍视野下计算贴壁细胞数目。

1.3.4 成血管能力检测 Matrigel 基质胶4℃过夜溶解后，采用M200无血清及生长因子补充物的培养基按1:1稀释Matrigel 基质胶，按50 μL/孔加入12 孔板，37℃孵箱放置30 min。使用胰酶消化对数期的各组细胞，DMEM 重悬，调整细胞密度至1×105个/μL，每孔加入1 mL 重悬液，待细胞贴壁加入8 mg/L FA 或PBS 进行干预。在37 ℃孵箱孵育培养24 h 后，倒置显微镜下观察并计数小管样结构。各组均随机选取4 个视野计算小管数，取平均值。本组实验重复3 次。

1.3.5 迁移能力检测 先用Marker 笔在6 孔板背后每隔1 cm 画一道横线，横穿过孔。每孔至少穿过5 条线。取对数生长期的EPCs，在孔中加入约5×105个细胞，预培养1 d 后用无菌200 μL 枪头在培养孔底部中央画一道痕迹，用PBS 洗去脱落的细胞。分别用含有8 mg/L FA 和PBS 液的无血清M199 完全培养基，在37℃、5% CO2培养箱中培养。选择2 个不同视野，用显微标尺，分别测量0 h 和24 h 的划痕创面边距并拍照。细胞迁移能力用迁移宽度表示。

1.3.6 SOD 检测 细胞培养第5 天换液，添加8 mg/L FA 或PBS，每组浓度设置3 个复孔，药物干预48 h 后，提取细胞上清液，根据试剂盒上的说明进行检测。在15 min之内，使用酶标仪测定450 nm的OD 值。

1.4 统计学方法 应用 SPSS 21.0 软件对实验数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，2 组间均数比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1EPCs 的分离和培养细胞培养7 d 后，呈典型的鹅卵石样，并表现出集落形态，中央细胞呈圆形，周边细胞呈梭形，见图1。

图1 第7 天原代人EPCs 的形态（光镜：A.×200；B.×400）

2.2 EPCs 的鉴定 原代人EPCs 细胞膜结合CD31 免疫荧光抗体呈绿色，细胞摄取DAPI核染呈蓝色，融合图像显示膜染绿色荧光，核染蓝色荧光，见图2。细胞结合 FITC-UEA-I呈绿色，细胞摄取Dil-ac-LDL 呈红色，两者双染呈橙黄色改变的细胞即为正常分化的EPCs，见图3。

图2 CD31 抗体联合DAPI核染鉴定结果（荧光镜，×400）

图3 双荧光染色鉴定结果（荧光镜，×400）

2.3 FA 处理对高糖受损EPCs 增殖曲线的影响 随着FA 处理浓度的增加，细胞活力逐渐升高，当FA 浓度为8 mg/L 时，细胞活动最高，16 mg/L 时逐渐降低，见图4，因此本实验选择最佳浓度8 mg/L 作为后续实验研究。

图4 不同浓度FA 对高糖受损EPCs 增殖活性曲线图

2.4 FA 对高糖受损EPCs 增殖、黏附、成血管及迁移能力的影响 实验结果提示，与正常EPCs 相比，模型组EPCs增殖能力、黏附能力、成管能力（成管数目）、迁移能力（迁移率）明显下降（P＜0.05），而FA干预后实验组细胞增殖能力、黏附能力、成血管能力、迁移能力显著增强（P＜0.05），见图5，图6，图7，图8。

图5 FA 对高糖受损EPCs 增殖能力影响

图6 FA 对高糖受损EPCs 黏附能力影响

图7 FA 对高糖受损EPCs 成血管能力影响

图8 FA 对高糖受损EPCs 迁移能力的影响

2.5 FA 对高糖受损EPCs 分泌SOD 的影响 ELISA检测各组SOD 的活性，研究发现与正常组相比，高糖诱导损伤的 EPCs 的SOD 活性明显下降（P＜0.05），8 mg/L 的FA 能够提高高糖损伤EPCs 中SOD 的活性，但无明显差异（P＞0.05），见图9。

图9 ELISA 检测FA 对高糖受损EPCs 分泌SOD 的影响

3 讨论

糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的多病因代谢紊乱疾病[9]。糖尿病常见的长期并发症之一是创面愈合障碍，约占糖尿病患者非创伤性截肢的50%。一项关于糖尿病患者截肢原因的回顾性研究提示创面愈合困难是81%的患者截肢的主要原因[10]。糖尿病患者的伤口愈合困难的主要原因是因为血管生成困难和新生血管的损害。EPCs 是来自造血干细胞系的干/祖细胞前体，通常被称为循环祖细胞，是负责内皮修复和新生血管生成的特殊细胞。在适宜环境下，EPCs 可以促进血管生成和血管修复，包括并入内皮、释放促进修复的生长因子和细胞因子[11]。研究[12]表明，在高血糖和糖尿病相关并发症中，EPCs 的数量、功能和基因表达均受到损害。

糖尿病患者的高血糖状态是内皮功能障碍的主要原因。高糖通过诱导氧化应激导致糖尿病患者EPCs功能障碍[13]，氧化应激可促进EPCs 凋亡[14]，并引起 EPCs 活性、迁移能力及成管等功能下降[15]。高血糖通过线粒体电子传递链过量产生超氧阴离子活性氧（ROS），后者在细胞功能障碍和糖尿病并发症的病理生理学中起重要作用。因此，慢性高血糖可能导致自由基产生过多，从而导致氧化应激，最终影响创面的愈合。故寻找抗氧化应激的药物可能是预防糖尿病血管稳态受损的重要治疗靶点。

本研究发现，FA 可显著提高高糖受损EPCs 的增殖、黏附、成管和迁移能力，表明FA 能保护高糖诱导损伤的EPCs。分离糖尿病患者EPCs，在体外用FA处理改善其功能，再用于自体EPCs 移植，有望提高自体细胞移植疗效，使其更加有效地促进血管生成和创面愈合，提高EPCs 治疗效果，预防截肢。

本研究发现，高糖环境下EPCs 中SOD 的活性明显下降，8 mg/L 的FA 能够提高其活性，但与对照组无明显差异，可能与FA 的浓度选择相关，亦可能与体外环境无法模拟体内的具体环境有关。目前EPCs 治疗尚未形成一套标准的表型和功能分析，亦未对细胞体内外环境的综合评价标准化。