升阳散火汤及其拆方对慢性疲劳小鼠骨骼肌线粒体动力学的影响研究

李玲玲，苏 磊，胡梦圆，张昕雨，鲁 艺

（北京中医药大学中医学院，北京 100029）

慢性疲劳综合征是一种涉及全身脏器，影响人们生活质量的复杂疾病，本病发生多与慢性应激相关[1-2]。近年来，慢性疲劳综合征的发病率越来越高[3]，但其发病机制尚不明确，目前认为主要涉及能量代谢紊乱、炎症反应、遗传因素等，线粒体动力学对细胞能量代谢具有重要的意义[4-5]。西医对此尚无令人满意的治疗方法，中医治疗此病的优势日益显现。中医学将慢性疲劳综合征归属于“虚劳”“郁证”范畴[6]。临床研究[7]结果表明，升阳散火汤可以显著改善CFS患者的症状和抑郁状态，但升阳散火汤治疗慢性疲劳综合征的机制尚不明确。其具体机制和拆方后的各个组合的抗疲劳作用尚值得进一步探讨。本研究采用冰水游泳、慢性束缚、夹尾复合方法构建慢性疲劳小鼠模型，从线粒体动力学的角度，探讨升阳散火汤及其拆方对慢性疲劳小鼠行为学及骨骼肌线粒体超微结构的影响，以期明确慢性疲劳小鼠的线粒体损伤情况及升阳散火汤及其拆方的干预效果。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性ICR 小鼠50 只，体质量（20±2）g，SPF 级，5～6 周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证编号：SCXK（京）2016-0006。完全按照动物中心饲养标准饲养，SPF 级环境，温度18～25℃，自由摄食和饮水，定期观察小鼠生长状况，及时更换垫料并定时给药。实验经过北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会审查。动物伦理号：BUCM -4 -2021030301-1017

1.2 药物制备 升阳散火汤所含药味生甘草（批号20022551）每袋24 g，相当于饮片120 g；防风（批号20008401）每袋12 g，相当于饮片120 g；升麻（批号20007371）每袋16 g，相当于饮片160 g；葛根（批号19029601）每袋16 g，相当于饮片160 g；独活（批号20009871）每袋32 g，相当于饮片160 g；白芍药（批号20020801）每袋8 g，相当于饮片160 g；羌活（批号20005711）每袋16，g 相当于饮片160 g；人参（批号20008481）每袋32 g，相当于饮片160 g；柴胡（批号20022891）每袋20 g，相当于饮片200 g；炙甘草（批号20018851）每袋24 g，相当于饮片120 g。取相当于饮片等量的各味药颗粒剂，混合后，用100 ℃蒸馏水配制成升阳散火汤水溶液备用。配方颗粒均由北京康仁堂药业有限公司提供，经北京中医药大学东方医院制剂室进行质量控制检测。

1.3 试剂及仪器

1.3.1 试剂BCA蛋白定量试剂盒（货号：PC0020）、RIPA裂解液（货号：R0020）、预染蛋白marker（货号：PR1920）、PVDF膜（货号：IPVH00010）、Super ECL Plus 升级版超敏发光液（货号：P1010），均购于北京拜尔迪生物科技有限公司；GAPDH（货号TA-08）、DRP1 Rabbit Antibody（货号：YT1414）、MFN1 Rabbit Antibody（货号YN3054）、OPA1 Rabbit Antibody（货号：YN2976）均购于Proteintech 公司；TEMED（货号：T8133）、辣根酶标记山羊抗兔IgG（货号：ZB-2301）、辣根酶标记山羊抗鼠IgG（货号：134560）均购于北京百诺威生物科技有限公司。

1.3.2 仪器 MIKRO 22R 低温冷冻离心机（德国Hettich 公司），TEM-1400plus 透射电子显微镜（日本电子株式会社），VE-180 电泳仪及电转仪（上海Tanon 科技有限公司），MULTISKAN MK3 酶标仪（美国Thermo Scientific 公司），610C 凝胶成像系统（北京赛智创业科技有限公司），SKY-200B 摇床（上海苏坤实业有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 动物模型制备 采用数字随机分组法将ICR 小鼠分为5组，即空白组、模型组、升阳散火汤全方组（生甘草、防风、升麻、葛根、独活、白芍、羌活、人参、柴胡、炙甘草）、补虚组（人参、芍药、生甘草、炙甘草），升阳散郁组（升麻、葛根、柴胡、防风、羌活、独活），每组10 只。除空白组外，采用单日进行束缚和力竭游泳，双日进行夹尾和束缚[8]复制慢性疲劳动物模型，在整个试验期间保持造模。

1.4.2 给药方法 升阳散火汤按照 《内外伤辨惑论》原方中记载的用量为升麻、葛根、独活、羌活、白芍药、人参（以上各五钱），甘草（炙）、柴胡（以上各三钱），防风（二钱五分），甘草（生，二钱）通过度量衡换算，金代一两约为现代 40 g，1 两=10 钱=100 分，据此折算为现代剂量进行制备（升麻、葛根、独活、羌活、白芍药、人参各20 g，炙甘草、柴胡各12 g，防风10 g，生甘草8 g），按照小鼠与人的体表面积及原药与颗粒剂比例折算小鼠的用药剂量，升阳散火汤组给药剂量为 2.73 g/kg、升阳散郁组给药剂量为 1.57 g/kg、补虚组给药剂量为 1.16 g/kg，每日1 次，连续灌胃4 周。

1.4.3 行为学测试 所有小鼠在造模第15 天、30 天、45 天进行称质量记录以及力竭游泳实验和悬尾静止实验。

1.4.4 超微结构观察 第45 天后，每组随机各取3 只取材，进行形态学观察。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后于右侧后肢分离骨骼肌（腓肠肌），取约1 mm×1 mm×3 mm 大小组织块。将取下骨骼肌标本置于3%戊二醛溶液中继续固定48 h 后，进行固定、脱水、包埋、切片，采用透射电子显微镜TEM-1400 plus观察骨骼肌的肌丝形态及线粒体超微结构变化。

1.4.5 Western blotting 分析 提取各组小鼠骨骼肌线粒体蛋白并用BCA 法进行蛋白定量，配制10%分离胶及浓缩胶，上样后进行SDS-PAGE 电泳（80 V 30 min，120 V 60 min），湿转法转膜（180 mA 90 min，0.45 μm 孔径PVDF 膜），5%脱脂牛奶封闭120 min后孵一抗4℃过夜，所用抗体为β-actin（1:30 000）、DRP1（1:500）、OPA1（1:1 000）、MFN1（1:500）。次日37 ℃孵二抗60 min，TBST 清洗3 次用ECL 化学发光液显色并进行凝胶成像系统曝光。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析，结果用均数±标准差（）表示。所有数据先经过方差齐性检验，方差齐采用多组单因素方差分析（One-way ANOVO），组间两两比较采用LSD法，方差不齐采用非参数检验（Kruskal-Wallis）。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 升阳散火汤及其拆方对慢性疲劳小鼠行为学的影响

2.1.1 对慢性疲劳小鼠体质量的影响 与空白组比较，模型组小鼠体质量增长缓慢（P＜0.05）；给药干预15、30 d 后与模型组比较，各组小鼠体质量差异无统计学意义。见表1。

表1 升阳散火汤及其拆方对慢性疲劳小鼠体质量的影响（，n =10） g

表1 升阳散火汤及其拆方对慢性疲劳小鼠体质量的影响（，n =10） g

注：与正常组比较，# P ＜0.05

2.1.2 对慢性疲劳小鼠力竭游泳时间的影响 各组小鼠造模15 d后，与正常组比较，模型组、升阳散火汤组、升阳散郁组、补虚组各组小鼠力竭游泳时间明显减少（P＜0.05）；给药干预15 d 后，与模型组比较，升阳散火汤组、补虚组力竭游泳时间明显升高（P＜0.05）其中以补虚组的效果最明显；给药干预30 d 后与模型组比较，升阳散火汤组、补虚组、升阳散郁组力竭游泳时间均显著升高（P＜0.05）。见表2

表2 升阳散火汤及其拆方对慢性疲劳小鼠力竭游泳时间的影响（，n =10） min

表2 升阳散火汤及其拆方对慢性疲劳小鼠力竭游泳时间的影响（，n =10） min

注：与正常组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

2.1.3 对慢性疲劳小鼠悬尾静止时间的影响 各组小鼠造模15 d 后，与正常组比较，模型组、升阳散火汤组、升阳散郁组、补虚组各组小鼠悬尾静止时间明显增加（P＜0.05）；给药干预15 d 后，与模型组比较，升阳散火汤组、升阳散郁组小鼠悬尾静止时间缩短（P＜0.05）；给药干预30 d 后，与模型组比较，升阳散火汤组及其拆方各组小鼠悬尾静止时间缩短（P＜0.05）。见表3。

表3 升阳散火汤及其拆方对慢性疲劳小鼠悬尾静止时间的影响（，n =10）

表3 升阳散火汤及其拆方对慢性疲劳小鼠悬尾静止时间的影响（，n =10）

注：与正常组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

2.2 骨骼肌超微电镜结果 空白组小鼠骨骼肌肌丝排列整齐，线粒体形状规则，呈椭圆形，膜结构完整，内嵴清晰。模型组小鼠骨骼肌线粒体形状不规则，膜溶解并相互连接，内嵴溶解缺失明显，排列紊乱。全药组小鼠骨骼肌肌节清晰，线粒体形态接近空白组，多呈椭圆形，膜结构较完整。升阳散郁组骨骼肌恢复程度不及升阳散火汤组，小鼠骨骼肌肌丝肌节欠清晰，明暗带差异不明显，线粒体多呈肿胀状态，基质变浅。补虚组肌节欠清晰，部分肌丝溶解，线粒体恢复程度优于升阳散郁组。见图1。

图1 小鼠线粒体电镜观察结果

2.3 Western blotting 结果 结果显示，与对照组比较，模型组线粒体融合相关蛋白MFN1、OPA1，线粒体分裂相关蛋白DRP1 表达水平显著下调（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，升阳散火汤组、补虚组、升阳散郁组OPA1 蛋白表达水平显著上调（P＜0.01），MFN 1 蛋白表达水平有上调趋势；升阳散火汤组、升阳散郁组DRP1蛋白表达水平显著上调（P＜0.05，P＜0.01），补虚组DRP1 蛋白表达水平下调（P＜0.05）。见图2。

图2 MFN1、OPA1、DRP1 蛋白表达结果

3 讨论

慢性疲劳综合征病程较长，病性以虚为主，或因虚致实，虚实夹杂。本研究从气虚生郁，郁而生热，内热耗伤气血的角度，选择升阳散火汤及其拆方进行慢性疲劳的研究。升阳散火汤出自李东垣《内外伤辨惑论·卷中》“暑伤胃气论”篇，是李东垣“火郁发之”之作，医方考载“升麻、柴胡、羌活、独活、防风、干葛，皆辛温上行之物也，故用之以升少阳之气，清阳既出上窍，则浊阴自归下窍，而食物传化自无抑遏之患；芍药味酸，能泻土中之木；人参味甘，能补中州之气；生甘草能泻郁火于脾，从而炙之，则健脾胃而和中矣”，其补气药与风药结合，既可补而不滞，又可散而无伤，补中升阳，相须为用，被认为是中医治法中“升阳散火”法的代表方。根据“法依病机、拆方依法”的拆方研究思路，可将升阳散火汤方拆分为两大方群，即一为补脾土，生气血（人参、白芍药、生甘草、炙甘草）；二为升清阳，散郁火（升麻、葛根、柴胡、羌活、防风、独活）。

慢性疲劳综合征是一个渐进过程，目前对于此疾病的动物模型构建缺乏统一的制定标准，我们在查阅大量资料后发现，采用复合因素建立慢性疲劳动物模型更接近于慢性疲劳综合征患者的临床表现[10-11]。本实验应激15 d 后，模型组小鼠较空白组的体质量及游泳时间明显下降，悬尾静止时间有增长趋势，表明本实验复制的疲劳动物模型符合慢性疲劳综合征的主要行为学特点[12]。

从建模第2 周开始，慢性疲劳综合征小鼠体质量明显增长缓慢，与文献报道[13-15]一致，说明束缚和强迫游泳可能造成小鼠产生类似慢性疲劳综合征患者体形消瘦的症状。在实验过程中升阳散火汤及其拆方各组小鼠体质量结果与模型组无差异，提示升阳散火汤及其拆方并不能增加慢性疲劳患者的体质量。力竭游泳时间被大多数研究者认为是能够反映出动物体力情况和衡量机体疲劳程度的经典指标[16]。根据动物研究表明，升阳散火汤全方及拆方均可延长小鼠游泳至力竭的时间，且短期内（给药2 周）补虚组效果更佳，长期（给药4 周）的慢性疲劳升阳散火汤全方效果更佳。提示长期慢性疲劳患者当以补虚与升阳散郁结合治疗的中医思路。在给药2 周时，补虚组对力竭游泳的指标改善作用优于升阳散火汤组和升阳散郁组，进一步提示短期慢性疲劳患者使用补虚法，可以起到最佳治疗效果。尾悬实验不仅能体现出小鼠的体力情况，还能体现出小鼠的情绪状态。本研究发现，模型组小鼠悬尾静止时间长于正常小鼠，与文献[13-15]报道一致。提示模型组小鼠体力下降，心理绝望感增加，升阳散火汤治疗30 d 后慢性疲劳小鼠的悬尾不动时间显著减少，提示升阳散火汤治疗后的小鼠体力较好，心理适应性较强。

本实验研究采用透射电镜观察疲劳对于小鼠骨骼肌线粒体结构损伤，发现慢性疲劳小鼠的骨骼肌及线粒体损伤严重，不易恢复，升阳散火汤可更好地保护骨骼肌及其线粒体膜结构的稳定性。本研究发现，模型组线粒体融合相关蛋白OPA1、MFN1，线粒体分裂相关蛋白DRP1 表达量显著下降，表明慢性疲劳可抑制小鼠骨骼肌线粒体分裂和融合，引起线粒体功能障碍。各给药组线粒体融合、分裂相关蛋白均有不同程度的调节，表明升阳散火汤及其拆方均可调控线粒体分裂和融合，增强线粒体功能以满足机体对能量的需求。

本研究结果表明，升阳散火汤及其拆方均具有提高小鼠抗疲劳能力。但从长期给药治疗的角度，单独补虚或者升阳散郁抗慢性疲劳效果均较整方差，提示李东垣升阳散火的治疗思想对慢性疲劳综合征的临床治疗具有实际意义。