提高黑米花色苷颜色稳定性辅色剂的筛选及其作用机制

赵 磊，潘 飞，周 娜，张雅莉，郝 帅，王成涛,

（1.北京工商大学，食品营养与人类健康北京高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048；2.谱尼测试集团股份有限公司，北京 100095）

黑米花色苷，一类由花青素与糖分子通过糖苷键结合而成的天然多酚类色素，存在于黑米种皮[1]，具有多种生理功效，如改善肠炎[2]、抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、改善视力[5]等。然而，花色苷稳定性较差，易受光、热、氧气等环境因素影响而发生降解和褪色[6-7]，这使开展提高天然色素颜色稳定性的研究成为当前热点。近年有关提高花色苷稳定性的研究可分为3 类：1）采用化学修饰提高花色苷对环境的耐受性，如酰基化、甲基化、糖基化等[8-9]；2）添加小分子酚类化合物作为辅色剂提高花色苷的颜色稳定性，如咖啡酸、单宁、香豆酸等[10]；3）采用蛋白质、多糖、脂质等生物大分子对花色苷进行微胶囊化，如海藻酸钠、乳清蛋白、壳聚糖[11-13]。然而，采用生物大分子进行微胶囊化，虽能够有效提高花色苷的稳定性，却在一定程度上降低了花色苷在溶液中原有的色彩和明度，而化学修饰则会引起消费者对健康的担忧。相比之下，作为辅色剂的小分子酚类化合物不仅能够对花色苷具有辅色作用，而且常在食品中作为的天然抗氧化剂，对人们健康具有多种益处[14-15]。因此，通过添加酚类辅色剂提高黑米花色苷的颜色稳定性具有十分重要意义。

研究表明，小分子酚类化合物可以通过非共价相互作用与花色苷形成复合物，保护花色苷不受水的亲核攻击，从而减少无色的半缩酮和查尔酮的形成，以此增强花色苷的颜色稳定性[16-18]。Zhang Lingli等[19]在加速条件下研究没食子酸对蓝莓汁中花色苷稳定性和色泽的影响，结果表明没食子酸的加入可提高蓝莓花色苷的颜色饱和度和稳定性，当蓝莓花色苷与没食子酸的物质的量比为1∶5时，辅色效果最佳。Babaloo等[10]考察不同pH值及4 种有机酸（单宁、咖啡酸、苯甲酸、香豆酸）对山茱萸花花色苷颜色的影响，结果表明在pH 2时，所选有机酸中对山茱萸花花色苷的辅色效果最为明显，其中，咖啡酸对山茱萸花花色苷稳定性的保护作用最佳。此外，Klisurova等[20]探究了10 种酚类化合物对黑山楂花色苷的辅色作用，其中迷迭香酸、丁香酸、儿茶素和表儿茶素具有较好的辅色效果。然而，现有研究有关辅色剂对黑米花色苷颜色稳定性影响的研究较少。此外，这种稳定性的保护作用机制也值得进一步探究，相关研究成果有助于黑米花色苷的开发及利用。

本研究选用7 种酚类化合物和有机酸，评价其在pH 3.0和pH 5.0条件下对黑米花色苷颜色稳定性的影响，以辅色效果和热稳定性为指标筛选辅色剂，并在pH 3.0时探究最佳辅色剂的添加质量浓度。随后，采用红外光谱、分子对接及分子动力学模拟进一步研究这种稳定性的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑米 市购；XAD-7吸附树脂 北京康林科技有限责任公司；表儿茶素、咖啡酸、迷迭香酸、绿原酸、草酸、苹果酸、丁香酸 成都曼斯特生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

H1850台式离心机 北京天林恒泰科技有限公司；HHSY21-Ni4恒温水浴锅 北京市精科华瑞仪器有限公司；真空冷冻干燥机 美国Labconco公司；JYL-C051粉碎机九阳股份有限公司；超声波清洗仪 北京中晟铭科技有限公司；RV10控制型旋转蒸发器 广州仪科实验室技术有限公司；NK200-1B可视孔氮吹仪 杭州米欧仪器有限公司；UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司；Avater 370红外光谱仪 美国尼高力公司。

1.3 方法

1.3.1 黑米花色苷分离纯化

参考Zhao Lei等[2]的方法进行略作修改，将黑米粉碎，取粉碎后的黑米30.0 g，加入85%酸性乙醇（HCl，pH 2.0），料液比为1∶10，避光超声提取2 次，超声时间30 min，过滤去除不溶性杂质，合并2 次提取液，旋蒸去除乙醇，用乙酸乙酯萃取除去黄酮。装填XAD-7树脂柱，上样，待吸附完全后，用6 倍柱体积酸性纯水（HCl，pH 3.0）洗去蛋白质、糖类等杂质，流速为1 mL/min；用1 倍柱体积酸性乙醇（HCl，pH 3.0）将花色苷洗脱下来，于40 ℃旋蒸浓缩至3 mL左右，氮吹至干，得到黑米花色苷粉末，置于离心管中－20 ℃条件下保存，待用。经测定，其花色苷主要组成为矢车菊-3,5-O-二葡萄糖苷（（6.4±0.1）mg/g）、矢车菊-3-O-葡萄糖（（406.7±2.2）mg/g）和芍药素-3-O-葡萄糖苷（（49.4±0.4）mg/g）。

1.3.2 花色苷总含量测定

采用pH示差法[21]测定黑米花色苷的总含量，取一定量的待测样，分别用pH 1.0和pH 4.5的缓冲液将样品稀释数倍，平衡10 min后，以纯水为空白，分别测定样液在波长515 nm和700 nm处吸光度，按下式计算花色苷总含量：

式中：M为花色苷质量浓度/（mg/L）；mw为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔质量（449.2 g/mol）；DF为稀释倍数；L为光程长（1 cm）；ε为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔吸光系数（26 900 L/（mol·cm））。

1.3.3 花色苷-辅色剂混合溶液的配制

使用0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 3.0和pH 5.0）分别配制0.1 mg/mL的黑米花色苷溶液和4.0 mg/mL的辅色剂溶液（表儿茶素、咖啡酸、迷迭香酸、绿原酸、草酸、苹果酸、丁香酸），取等体积黑米花色苷溶液和辅色剂溶液混合均匀后，在室温条件下避光放置1 h，以添加等体积柠檬酸缓冲液的黑米花色苷溶液做为对照组。

1.3.4 辅色剂的筛选及辅色剂质量浓度的确定

采用辅色效果结合热稳定性共同评价辅色剂对黑米花色苷颜色稳定性的影响，以筛选最佳辅色剂进行后续实验。

1.3.4.1 辅色剂种类对黑米花色苷辅色效果的影响

采用紫外分光光度计在波长400～700 nm范围测定上述样品在最大吸收波长处的吸光度，并计算出各个辅色剂的增色效应和红移效应的值。增色效应即花色苷溶液紫外最大吸收波长下的吸光度变化百分比（ΔAλmax），红移效应即花色苷溶液紫外最大吸收波长增加量（Δλmax）。当花色苷溶液发生红移现象时，其紫外最大吸收波长变大，花色苷溶液红色加深；与之相对的，当发生蓝移现象时，其紫外最大吸收波长减小，花色苷溶液红色变浅或有变蓝的趋势。增色效应和红移效应的值越大，说明辅色剂对黑米花色苷的辅色性越好。

1.3.4.2 辅色剂种类对黑米花色苷热稳定性的影响

将1.3.3节配制的花色苷-辅色剂溶液避光置于90 ℃水浴中，于0、5、10、20、40、80、120 min和160 min分别测定其最大吸收波长处的吸光度，从而监测各组样品在90 ℃水浴时的吸光度变化，即其热稳定性。

1.3.4.3 辅色剂质量浓度的确定

在上述研究的基础上，选择辅色效果最好的辅色剂，分别配制pH 3.0质量浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL的辅色剂溶液，取等体积辅色剂溶液与质量浓度为0.1 mg/mL的黑米花色苷溶液（pH 3.0）混和，必要时调节pH值至3.0。随后采用1.3.4.1节方法确定辅色剂的最佳浓度。

1.3.5 傅里叶红外光谱分析

分别配制质量浓度为0.1 mg/mL的黑米花色苷溶液和4.0 mg/mL迷迭香酸溶液，取相同体积并混合均匀。使用真空冷冻干燥机干燥成粉末，分别称取约10 mg黑米花色苷、迷迭香酸及黑米花色苷+迷迭香酸复合物，以KBr压片，波段范围为400～1 000 cm－1，分辨率为8 cm－1，扫描次数为32 次，用傅里叶红外光谱仪测定。

1.3.6 计算机模拟

参考Li Caixia等[22]的研究方法并进行略微修改，采用分子对接获得最佳结合构象，并进行分子动力学模拟分析最佳辅色剂与花色苷之间的相互作用。矢车菊-3-O-葡萄糖苷和迷迭香酸的3D结构从PubChem数据库下载（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov），编号分别为197081和5281792。矢车菊-3-O-葡萄糖苷和迷迭香酸的拓扑结构由GlycoBioChem PRODRG2 Server（http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/prodrg）创建[23]，其几何结构和电荷性质根据Lemkul等[24]提出的方法进行修正。

1.3.6.1 分子对接

采用AutoDock Tools 1.5.6软件（http://autodock.scripps.edu）处理矢车菊-3-O-葡萄糖苷和迷迭香酸，合并非极性氢原子，并保存为pdbqt格式。矢车菊-3-O-葡萄糖苷和迷迭香酸的结合采用AutoDock Vina软件进行盲对接获得最佳结合构象[25]。相比较AutoDock 4，Vina具有高精度，速度快且可提高结合模型预测的准确性，所对接计算的网格大小为16 Å×12 Å×16 Å，网格空间为1 Å，Exhaustiveness设置为200 次，产生20 个结合构象，其他参数设置为默认值。最后，以结合能和最佳均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）选择矢车菊-3-O-葡萄糖苷和迷迭香酸的最佳对接构象。

1.3.6.2 分子动力学模拟

分子对接得到最佳结合几何构象作为分子动力学模拟的初始几何，对有无添加辅色剂的花色苷体系进行10 ns动力学模拟。模拟体系在矩形的盒子进行，加入外显溶剂（spc水模型），所有原子之间保持10 Å的距离，并加入超过800 个水分子，添加反离子用于中和体系电荷，以保证体系中正确的渗透压和电中性。采用最陡下降法优化分子体系的几何结构并进行能量最小化（最大设置为1 000.0 kJ/（mol/nm））。能量最小化后，体系经过正则系综（0.2 ns）和等温等压系综（1 ns）两步骤达到平衡。本研究中分子动力学模拟均使用GROMACS（Version.2019.5）软件包进行（http://www.gromacs.org），力场采用GROMOS96 43a1[26]，所有含氢原子的键使用默认线性（LINCS）算法进行约束[27]。恒温（300 K）使用V-rescale方法，恒压（1 bar）使用Parrinello-Rahman方法，并分别进行0.1 ns和2 ns。采用粒子网格方法处理远距离静电力，以14 Å截断量计算范德华力，时间步长1 fs，每0.1 ps收集一次快照。模拟结束后，使用GROMACS（Version.2019.5）软件包分析轨迹。所有图片经过PyMOL软件处理。

1.4 数据处理和统计分析

2 结果与分析

2.1 辅色剂种类对黑米花色苷辅色效果的影响

选用7 种酚类化合物和有机酸作为辅色剂，并研究其种类对黑米花色苷辅色效果的影响，结果如表1所示。7 种辅色剂均能提高黑米花色苷的增色效应和红移效应，在pH 3.0时，添加迷迭香酸的花色苷溶液增色和红移效应最好（P＜0.05），分别增加29.16%和9 nm，而添加草酸的花色苷溶液增色效应增加16.00%，但其出现蓝移。此外，表儿茶酸和咖啡酸的增色效果较差。在pH 5.0时，7 种辅色剂对黑米花色苷的增色效果从大到小依次为迷迭香酸（23.78%）、绿原酸（21.66%）、草酸（17.05%）、表儿茶素（16.29%）、咖啡酸（12.84%）、丁香酸（11.31%）和苹果酸（7.37%）。在类似的研究中，添加绿原酸、迷迭香酸也被证实可提高花色苷的颜色稳定性[20,30]，在本研究中迷迭香酸对黑米花色苷的辅色效果显著优于绿原酸（P＜0.05）。此外，溶液pH值不同导致辅色剂对黑米花色苷的增色和红移效应出现差异，这可能是因为在pH 5.0时，花色苷分子内电荷容易发生转移，并水解黄烊阳离子C环双键，导致黑米花色苷稳定性降低[28]。

表1 辅色剂对黑米花色苷的增色效应和红移效应Table 1 Hyperchromic effect (ΔAλmax) and bathochromic shift effect(Δλmax) of co-pigments on black rice anthocyanins

2.2 辅色剂种类对黑米花色苷热稳定性的影响

如图1所示，在pH 3.0时，随着加热时间的延长，所有组溶液的吸光度均出现降低，这表明色素配合物变得不稳定，溶剂化对黄烊阳离子的影响占主导作用，从而使花色苷发生水化导致无色甲醇假碱和查尔酮的形成[29]。添加表儿茶素、咖啡酸、迷迭香酸、绿原酸、草酸、苹果酸和丁香酸的吸光度在加热160 min后与初始时相比分别降低了29.5%、30.2%、29.3%、32.4%、30.2%、34.2%和26.5%，不添加辅色剂的对照组吸光度在加热160 min后降低35.6% （图1A），这表明所选7 种酚类化合物均可提高黑米花色苷的热稳定性，其中绿原酸对黑米花色苷的影响与Gras等[30]的研究一致。与pH 3.0相比，pH 5.0体系中所有组的吸光度初始值均出现下降，这是因为在pH 3.0条件下，花色苷的结构呈黄烊阳离子有利于花色苷颜色稳定，当pH值升高至5.0时，其结构逐渐转化为无色的查尔酮导致吸光度降低[28]。与对照组（pH 5.0）相比，添加表儿茶素、咖啡酸、迷迭香酸、绿原酸、草酸和丁香酸的吸光度在加热80 min后与初始时相比分别降低了13.6%、22.7%、13.2%、17.0%、26.0%和19.1%，而添加苹果酸的吸光度与空白组无明显差异（图1B）。这些结果表明添加表儿茶素、迷迭香酸、绿原酸和丁香酸均能有效提高黑米花色苷的热稳定性，其中添加表儿茶素和迷迭香酸后花色苷的热稳定性最好。因此，根据辅色效果和热稳定性选择迷迭香酸和pH 3.0用于后续实验探究。

图1 辅色剂种类对黑米花色苷在90 ℃热稳定性的影响Fig.1 Effect of co-pigments on thermostability of black rice anthocyanins in water bath at 90 ℃

2.3 迷迭香酸质量浓度对黑米花色苷辅色效果的影响

选用迷迭香酸进一步探究其质量浓度对黑米花色苷辅色效果的影响，以确定迷迭香酸的最佳质量浓度，结果如表2所示。当迷迭香酸质量浓度从0.1 mg/mL升高至4.0 mg/mL时，黑米花色苷溶液的增色效应从1.50%增加至47.38%，红移效应则从0 nm增加至12 nm。这表明辅色效果与迷迭香酸的质量浓度有关，随着迷迭香酸质量浓度的增加，辅色效应逐渐增强。一些研究表明多酚分子间发生缔合所形成的重叠排列，有利于辅色效果的提高[31]。在类似的研究中，没食子酸、单宁酸、香豆酸、咖啡酸均被观察到其浓度增加导致花色苷辅色效果增强[10,19]。

表2 迷迭香酸对黑米花色苷的增色效应和红移效应Table 2 Hyperchromic effect (ΔAλmax) and bathochromic shift effect(Δλmax) of rosmarinic acid on black rice anthocyanins

2.4 迷迭香酸质量浓度对黑米花色苷热稳定性的影响

如图2所示，在90 ℃水浴加热，所有组的吸光度均随加热时间的延长下降，其中，添加迷迭香酸组（质量浓度由高到低）在加热160 min后与初始时相比分别降低33.5%、24.9%、20.2%、20.1%、24.5%、28.7%，而对照组的吸光度降低25.9%。然而，高质量浓度迷迭香酸对黑米花色苷虽具有较好的辅色效果，但在加热160 min后其吸光度下降速度高于其他组，且与添加质量浓度为2 mg/mL迷迭香酸组的吸光度相当，这表明其对黑米花色苷的热稳定性低于2 mg/mL迷迭香酸组。因此，结合辅色效果来看，迷迭香酸添加质量浓度为2 mg/mL时，其对黑米花色苷颜色稳定性最好。

图2 迷迭香酸对黑米花色苷在90 ℃时热稳定性的影响（pH 3.0）Fig.2 Effect of rosmarinic acid on thermal stability of black rice anthocyanins in water bath at 90 ℃ (pH 3.0)

2.5 傅里叶红外光谱分析

采用红外光谱检测，并根据振动谱带的强度、宽度和峰的位置分析两者分子间相互作用，进一步研究迷迭香酸对黑米花色苷颜色稳定性的保护作用，结果如图3所示。在图3A中，3 353 cm－1和2 925 cm－1左右的谱带分别表示O—H伸缩振动和C—H伸缩振动，在1 690 cm－1处与C＝O拉伸振动有关，而1 626 cm－1处的谱带属于芳烃骨架的C＝C伸缩振动。在1 170 cm－1处的强谱带表示吡喃环OH取代基的C—O伸缩振动，1 107 cm－1和1 059 cm－1处的弱谱带则归因于芳香环的C—O—C伸缩振动，这些均属于黄酮类化合物的典型特征[32]。在图3B中，在3 230（O—H拉伸）、1 722（C＝O拉伸）、1 626 cm－1和1 549 cm－1（C＝C拉伸）处，迷迭香酸的红外光谱显示出特征性的条带，在1 187、1 142 cm－1和1 003 cm－1处的谱带均归因于酚类基团的C—O伸缩振动[33]。与黑米花色苷和迷迭香酸的红外光谱图相比，黑米花色苷+迷迭香酸复合物的红外光谱有所不同，其O—H基团拉伸振动峰从3 353 cm－1和3 230 cm－1移动到3 294 cm－1，这表明黑米花色苷和迷迭香酸之间形成了分子间氢键（图3C）。此外，与迷迭香酸的红外光谱图相比，黑米花色苷+迷迭香酸复合物的红外光谱图位于1 187～1 004 cm－1处的谱带整体向高波长方向移动。相对于黑米花色苷的红外光谱图而言，其位于1 551～1 375 cm－1范围内的谱带强度出现降低，表明多酚类物质（黑米花色苷和迷迭香酸）之间可能存在π-π堆积或其他相互作用[5]。总之，傅里叶红外光谱表明，氢键是黑米花色苷和迷迭香酸结合的主要驱动力之一。

图3 黑米花色苷（A）、迷迭香酸（B）和黑米花色苷与迷迭香酸复合物（C）的红外光谱图Fig.3 FT-IR spectra of black rice anthocyanins (A), rosmarinic acid (B) and their mixture (C)

2.6 分子对接分析

采用AutoDock Vina进行分子对接可以探索2 个分子最佳稳定构型及结合能，所得结合体的构象自动聚类分析并打分，可有效排除人为因素的干扰[21]。矢车菊-3-O-葡萄糖苷与迷迭香酸对接结果如表3所示，根据结合能最低和RMSD值优选模型1作为分子动力学模拟的启动配制。

表3 矢车菊-3-O-葡萄糖苷与迷迭香酸分子对接结果Table 3Results of molecular docking between cyanidin-3-O-glucoside and rosmarinic acid

2.7 分子动力学模拟分析

采用分子动力学可模拟真实体系下分子间的结合及相互作用，并进行可视化分析，使实验数据得到较好补充和验证[26,34-35]。为了准确分析矢车菊-3-O-葡萄糖与迷迭香酸的相互作用，本研究进行了10 ns分子动力学模拟，结果如图4所示。矢车菊-3-O-葡萄糖与迷迭香酸之间形成2 条强氢键，其键长分别为1.6 Å和1.9 Å，主要发生在矢车菊-3-O-葡萄糖中葡萄糖苷上羟基的H和迷迭香酸中B环酚羟基的O原子之间，氢键作为是分子间最重要的相互作用之一，其稳定了矢车菊-3-O-葡萄糖与迷迭香酸结合构象（图4A），进而提高二元复合物的稳定性，这与先前研究的结果一致[26,34]。此外，矢车菊-3-O-葡萄糖中A和C环与迷迭香酸中苯环可形成多个π-π堆积，这对维持多酚类之间的稳定性尤为重要。许多研究表明，在花色苷-辅色剂之间可通过分子间相互作用影响溶液的颜色。其中，氢键和非共价作用力被认为是分子间辅色形成的主要因素，能够稳定花色苷阳离子发色团并阻止它与水分子的相互作用，从而保持溶液颜色不发生损失[36-38]。当花色苷与酚酸处于层状堆积结构时，酚酸可向花色苷提供丰富的p电子，从而产生增色效应[39-40]。Fan Linlin等[35]发现酚类物质可通过氢键和非共价相互作用对黑莓酒渣花色苷产生增色效应，并提高其稳定性，这与本实验结果一致。此外，迷迭香酸的多苯环结构会引发聚偶叠作用，可能是其在所选7 种辅色剂中具有最大增色和红移效应（表1）的原因[41-42]。

图4 矢车菊-3-O-葡萄糖-迷迭香酸二元络合物体系及矢车菊-3-O-葡萄糖体系的分子动力学模拟Fig.4 Molecular dynamic simulation obtained for cyanidin-3-O-glucoside-rosmarinic acid binary composite system

从体系稳定性看，RMSD值可以反映系统中任意时刻构象与初始构象的相对变化。从图4B可知，矢车菊-3-O-葡萄糖-迷迭香酸体系的平均RMSD值在0.20 nm左右变化，经过10 ns分子动力学模拟后达到相对稳定的状态，表明体系的总体稳定和平衡，而矢车菊-3-O-葡萄糖体系虽然也达到平衡，但其浮动范围大于矢车菊-3-O-葡萄糖-迷迭香酸体系，这也表明二元复合物体系更加有利于矢车菊-3-O-葡萄糖稳定。

此外，通过计算溶剂可及表面积可以确定矢车菊-3-O-葡萄糖的残基溶剂可及性的变化，其作为分子表面与溶剂分子相互作用比例的参数，可用于预测结合过程中发生构象变化的程度。图4C显示为2 种体系中矢车菊-3-O-葡萄糖的溶剂可及表面积变化值，与矢车菊-3-O-葡萄糖体系不同的是，矢车菊-3-O-葡萄糖-迷迭香酸体系在1 ns左右出现下降随后趋于稳定，类似研究表明疏水相互作用可能有利于矢车菊-3-O-葡萄糖与迷迭香酸的结合[26,35]。综上所述，分子动力学模拟表明迷迭香酸主要通过氢键和π-π堆积作用力与花色苷结合，从而对花色苷的稳定性起到保护作用，这些结果与实验研究的结果一致。

3 结 论

本研究选用7 种酚类化合物和有机酸（表儿茶素、咖啡酸、迷迭香酸、绿原酸、草酸、苹果酸、丁香酸），结合辅色效果和热稳定性评价其在pH 3.0和pH 5.0条件下对黑米花色苷颜色稳定性的影响。结果表明，除苹果酸外，其余6 种辅色剂均对黑米花色苷在pH 3.0和pH 5.0条件下具有较好的辅色效果并能提高其热稳定性，其中在pH 3.0条件下添加迷迭香酸的效果最佳。在所选质量浓度范围内（0.1～4.0 mg/mL），迷迭香酸质量浓度越高对黑米花色苷的辅色效果越好，添加质量浓度2.0 mg/mL的迷迭香酸对黑米花色苷颜色稳定性的保护作用最好。红外光谱、分子对接及分子动力学模拟表明迷迭香酸可通过氢键和π-π堆积相互作用力与花色苷结合，从而提高黑米花色苷的稳定性。因此，为了提高黑米花色苷的颜色稳定性，扩大其在功能和营养食品中的应用，可考虑添加迷迭香酸作为辅色剂。