黄 锐,王 剑△,谭 慧,周利平,杨化冰,刘 娟
1.利川市人民医院心血管内科,湖北利川 445400;2.恩施州中心医院西医部药剂科,湖北恩施 445000
急性心血管事件是人类死亡的主要原因之一,伴随人口老龄化的加重,心血管疾病的发生率逐年增加[1-3]。心肌缺血再灌注可加重心肌细胞甚至心脏结构的损伤,严重影响心脏功能[4-6]。心肌细胞凋亡是导致心肌缺血再灌注损伤的重要原因[7-8]。因此,降低心肌细胞凋亡率是预防和治疗心肌缺血再灌注损伤的关键。长链非编码RNA(lncRNA)是一种高度保守的单链内源性RNA,长度超过200个核苷酸[9-10]。lncRNA广泛参与调控基因的表达,在细胞的发育、增殖、衰老、凋亡等进程中发挥关键作用[11-12]。越来越多的研究发现,心肌细胞损伤伴随lncRNA表达谱的改变,lncRNA表达增加或降低可导致心律失常、心肌肥大、心肌梗死等各种心脏疾病[13]。全血lncRNA的表达水平是诊断心血管疾病的重要标志物[14]。RPA3-AS1是近年来新发现的lncRNA,RPA3-AS1在人类疾病特别是心血管疾病的关系尚不明确。本研究旨在探讨RPA3-AS1是否在心肌缺血再灌注损伤中发挥作用,探究RPA3-AS1在心肌细胞中可能的作用机制。
1.1材料
1.1.1临床标本 收集2019年1月至2020年6月利川市人民医院心血管内科治疗的43例急性心肌缺血患者(患者组)全血标本,以及同期43例体检健康者(健康组)全血标本。本研究得到利川市人民医院伦理委员会批准,受试者均签署知情同意书。
1.1.2细胞与试剂 人心肌细胞系AC16购于中科院上海细胞库。高糖DMEM培养基和胎牛血清购于美国Hyclone公司。实时定量聚合酶链反应(qPCR)试剂盒和转染试剂LipofectamineTM3000购于美国Invitrogen公司。噻唑蓝(MTT)试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。TRizol裂解液购于美国Sigma公司。载有RPA3-AS1序列的质粒和阴性对照质粒购于上海和元生物技术股份公司。一抗和二抗购于美国Abcam公司。Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养和转染 于37 ℃、5% CO2的培养箱中,人心肌细胞系AC16培养在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的高糖DMEM培养基中。将对数生长期AC16细胞接种于6孔板,待细胞密度达到60%时,根据LipofectamineTM3000转染试剂说明书,转染载有RPA3-AS1序列的质粒(实验组)和阴性对照质粒(对照组),培养箱中继续培养48 h。
1.2.2qPCR检测 RPA3-AS1、miR-203a-3p和BAG3 mRNA的表达 采用TRIzol-氯仿-异丙醇体系提取全血标本和细胞系总RNA,逆转录合成cDNA。qPCR反应条件为95 ℃ 6 min,95 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,总共40个循环。采用2-ΔΔCt方法计算RPA3-AS1、miR-203a-3p和BAG3 mRNA相对表达量。以GAPDH为内参检测RPA3-AS1和BAG3 mRNA的表达;以U6为内参检测miR-203a-3p的表达。引物序列如下,miR-203a-3p正向引物:CCG GTG AAA TGT TTA GGA CCA CTA G,反向引物:GCC GCG TGA AAT GTT TAG G;GAPDH正向引物:CTG GGC TAC ACT GAG CAC C,反向引物:AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG;BAG3正向引物:AGC TCC GAC CAG GCT ACA TT,反向引物:GGA TAG ACA TGG AAA GGG TGC。U6正向引物:CTC GCT TCG GCA GCA CA,反向引物:AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT。
1.2.3MTT法检测AC16细胞活力 将对数生长期的两组细胞接种于96孔板,每孔5×103个细胞,每孔加入200 μL培养基。分别在接种后第1、2、3、4、5 d两组的细胞活性。MTT检测时,在各孔细胞中加入20 μL MTT试剂(浓度为5 g/L),在培养箱中培养4 h后吸去液体,各孔加入150 μL二甲基亚砜,室温下在震荡摇床振荡至结晶完全溶解,酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度(A)值(反映细胞活力)。
1.2.4流式细胞术检测AC16细胞凋亡率 收集对数生长期的两组细胞,采用PBS溶液洗3次,采用binding buffer重悬细胞并调整细胞密度。分别取100 μL细胞悬液,加入5 μL Annexin V-FITC并混匀,加入5 μL PI并混匀,在培养箱内避光培养15 min。加入100 μL binding buffer并混匀,在1 h内采用流式细胞仪检测两组细胞的凋亡率。
1.2.5生物信息学方法预测RPA3-AS1的作用机制 采用生物信息学软件starBase v2.0预测RPA3-AS1可配对结合的miRNA。采用生物信息学软件miRWalk 2.0和DIANA-microT预测miR-203a-3p可配对结合的靶基因mRNA。
1.2.6Western blot法检测BAG3蛋白和相关凋亡蛋白的表达 采用细胞裂解液提取细胞总蛋白,检测蛋白浓度,每组取35 μg总蛋白行聚丙烯酰胺凝胶电泳。硝酸纤维素膜转膜后,采用5%脱脂牛奶封闭1 h。加入一抗在4 ℃下孵育过夜。洗膜后,加入二抗在室温下孵育2 h。滴加ECL发光液,在成像系统中采集图像。
2.1两组受试者全血中RPA3-AS1的表达 健康组和患者组全血中RPA3-AS1的相对表达水平分别为6.19±0.57和1.35±0.41,与健康组相比,患者组全血RPA3-AS1的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。
注:与健康组相比,aP<0.01。
2.2两组AC16细胞中RPA3-AS1的表达 健康组和患者组AC16细胞中RPA3-AS1相对表达水平分别为1.01±0.07和9.91±1.27,患者组RPA3-AS1相对表达水平显著高于健康组,差异有统计学意义(P<0.01)。
2.3高表达RPA3-AS1抑制AC16细胞活力 MTT法结果显示,从第2 天起,患者组AC16细胞活力显著高于健康组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。
注:与健康组相比,bP<0.05,aP<0.01。
2.4高表达RPA3-AS1抑制AC16细胞凋亡 流式细胞术显示,转染质粒48 h后,患者组和健康组AC16细胞凋亡率分别为(3.93±0.62)%和(10.76±1.48)%,与健康组相比,高表达RPA3-AS1显著抑制AC16细胞的凋亡,差异具有统计学意义(P<0.01)。见图3。
注:与健康组相比,aP<0.01。
2.5生物信息学方法预测RPA3-AS1的作用机制 采用生物信息学软件starBase v2.0预测RPA3-AS1可配对结合miR-203a-3p。采用生物信息学软件miRWalk 2.0和DIANA-microT预测miR-203a-3p可配对结合BAG3 mRNA。见图4。
图4 生物信息学方法预测RPA3-AS1的作用机制
2.6高表达RPA3-AS1的AC16细胞中miR-203a-3p和BAG3 mRNA的表达 qPCR结果显示,患者组和健康组AC16细胞miR-203a-3p的相对表达水平分别为0.26±0.04和1.03±0.14,高表达RPA3-AS1可抑制miR-203a-3p的表达(P<0.01)。患者组和健康组AC16细胞BAG3mRNA的相对表达水平分别为4.59±0.56和1.03±0.08,miR-203a-3p表达水平降低后,BAG3 mRNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。
2.7高表达RPA3-AS1促进BAG3蛋白表达 Western blot结果显示,高表达RPA3-AS1的AC16细胞中,BAG3蛋白表达水平明显升高,BAG3蛋白表达水平升高后,细胞中Bcl-2和p53蛋白表达水平升高,Bax和Caspase-8蛋白表达水平降低。见图5。
图5 Western blot法检测BAG3蛋白及相关凋亡蛋白表达情况。
lncRNA是一种内源性的非编码RNA,参与调控基因的转录和翻译,影响细胞的各种生命进程[15-16]。越来越多的lncRNA如H19、AK139328、TUG1、KCNQ1OT1、MALAT1等被证实与心血管疾病的发生、发展密切相关,在心肌缺血再灌注损伤中发挥关键调控作用[17-20]。RPA3-AS1是近年来新发现的lncRNA,其作用机制尚未见报道。本研究中,通过检测健康组和患者组全血标本发现,RPA3-AS1在患者组全血标本中的表达明显低于健康组,表明其可能在心肌缺血中发挥重要作用,可能与心肌缺血再灌注损伤相关。临床研究表明,心肌细胞凋亡可能是心肌缺血再灌注损伤发生的主要因素[21-22]。本研究结果表明,心肌细胞高表达RPA3-AS1后,心肌细胞的活力显著增加,心肌细胞的凋亡率显著降低,RPA3-AS1可增强心肌细胞活力并抑制其凋亡。
近年来研究发现,lncRNA主要通过以不完全互补配对的方式与微小RNA(miRNA)结合,抑制miRNA与靶基因mRNA的配对结合,在转录后水平促进miRNA靶基因的表达[23]。本研究通过生物信息学软件starBase v2.0预测,RPA3-AS1可配对结合miR-203a-3p。miR-203a-3p可促进脂多糖诱导的心肌细胞凋亡和炎症,沉默miR-203a-3p可下调心肌细胞凋亡蛋白的表达,降低心肌细胞的凋亡率[24]。本研究结果表明,高表达RPA3-AS1后,人心肌细胞中miR-203a-3p表达水平降低,RPA3-AS1可抑制miR-203a-3p的表达。本研究通过生物信息学软件miRWalk 2.0和DIANA-microT预测,miR-203a-3p可配对结合Bcl-2相关抗凋亡蛋白3(BAG3)mRNA。BAG3蛋白是一种高度保守的热休克蛋白70(HSP70)分子结合伴侣,属于抗凋亡基因(BAG)家族蛋白,可在多个水平调控细胞的活性、凋亡、转移等生理过程[25]。BAG3蛋白可抑制心肌细胞的凋亡,BAG3蛋白表达缺失与缺血再灌注心肌损伤密切相关[26]。本研究结果表明,miR-203a-3p表达降低后,人心肌细胞中BAG3基因表达显著升高,表明miR-203a-3p可能发挥抑制BAG3基因表达的作用。Bcl-2和p53蛋白具有抑制细胞凋亡的作用,Bax和Caspase-8蛋白具有促进细胞凋亡的作用,因此,Bcl-2、p53、Bax和Caspase-8蛋白表达水平可反映细胞凋亡情况。本研究发现,高表达RPA3-AS1后,人心肌细胞中Bcl-2和p53蛋白表达升高,Bax和Caspase-8蛋白表达降低,提示RPA3-AS1可抑制心肌细胞的凋亡,从而可能预防和治疗心肌缺血再灌注损伤。本课题组下一步将通过双荧光素酶报告基因实验证实RPA3-AS1与miR-203a-3p及miR-203a-3p与BAG3 mRNA之间的配对结合。
lncRNA RPA3-AS1可能通过调控miR-203a-3p/BAG3分子轴促进人心肌细胞的活性并抑制其凋亡。本研究首次揭示RPA3-AS1在人心肌缺血再灌注损伤中的作用及可能的作用机制,为RPA3-AS1的临床应用提供了一定的实验基础。