同位素内标-液相色谱-串联质谱法测定动物性食品中氟虫腈及其代谢物残留

周鸿，谭洪涛，于晖，李娟，谢慧英

（江西省疾病预防控制中心 江西省食源性疾病诊断溯源重点实验室，江西 南昌 330029）

氟虫腈是一种苯基吡唑杀虫剂[1-3]，可作为中枢神经系统γ-氨基丁酸(GABA)门控氯通道的非竞争性阻断剂[4]，具有广谱杀虫效果，推广于各行业的害虫防治[5,6]。2017年欧洲出现“毒鸡蛋”事件，引起国内外对氟虫腈及其代谢物在动物源食品中残留的关注[7]。氟虫腈在动物体内产生三种代谢产物：氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜[8]（见图1），而代谢产物的毒性要高于氟虫腈[9]。由于摄入过量的氟虫腈对人体神经系统、肝脏、消化系统、甲状腺均有损害，故欧盟、日本和国际食品法典委员会严格规定了氟虫腈及其代谢产物的最大残留限量（MRL）[10,11]，我国也在GB 2763-2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定蛋类和禽肉类中氟虫腈的MRL分别为0.02mg/kg和0.01mg/kg[12]，氟虫腈残留量包含氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜总量。

图1 氟虫腈及其代谢物的化学结构

目前，测定氟虫腈及其代谢物的主要方法有气相色谱法（GC）[13-15]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[16,17]、液相色谱法（HPLC）[18,19]和液相色谱-串联质谱法[20-22]。动物性食品具有基质复杂、前处理过程繁琐、干扰较大、耗时长的特点，针对这一特性，本研究采用PRiME HLB通过式净化方法[23,24]，省去了传统固相萃取的活化、平衡和洗脱等步骤，样品经提取后直接过柱，能快速、有效除地去动物性食品中的杂质，有效降低样品的基质效应，从而提高方法的精密度和灵敏度。同时结合同位素内标-UPLC-MS/MS技术，建立了测定动物性食品中氟虫腈及其代谢物的方法。该方法简单快捷、灵敏度高，适用于大批量氟虫腈检测需求。

1 材料与方法

样本采集：鸡肉和鸡蛋均购自本地超市和农贸市场。

2 仪器与方法

2.1 仪器与试剂QTRAP 5500质谱仪（美国SCIEX公司）；高速低温离心机（德国Sigma公司）；涡旋振荡器（德国Heidolph公司）；Oasis PRiME HLB SPE（300mg/3ml，美国Waters公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；MS304S电子天平（梅特勒-托利多公司）。

氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜标准品（浓度为100 μg/ml，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；13C215N2-氟虫腈（First Standard公司）；乙腈和甲酸（色谱纯，德国Merck公司）；乙酸铵（阿拉丁公司）、氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），实验用水由Milli-Q超纯水系统制得。

2.2 标准溶液的配制 分别准确称取适量氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和13C215N2-氟虫腈标准品，用乙腈溶解并定容，配制成质量浓度为100 mg/L的氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜标准储备液和100 mg/L的内标储备液，于-18°C避光保存；移取氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和内标储备液，根据需要用50%乙腈逐级稀释，配制适当浓度的标准工作液（含氟虫腈内标2 μg/L），现用现配。

2.3 色谱-质谱条件 色谱柱：BEH C18色谱柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；柱温：40°C；进样量2μl；流动相A：含0.1%（v/v）甲酸的1mmoL乙酸铵溶液，流动相B：甲醇；流速：0.3ml/min。梯度洗脱程序：0～1.0min,25%B；1.0～5.0min,65%B～95%B；5.0～7.0min,95%B；7.1～9.0 min,25%B。进样体积2μl。

离子源：电喷雾电离（ESI）源，负离子模式：多反应监测（MRM）；气帘气（Curtain gas）:35.0 L/h；雾化气（Gas1）：50.0 L/h；加热辅助气（Gas2）流量：50.0 L/h；喷雾电压 （IS）：4500 V；离子源温度（TEM）500 °C；氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和13C215N2-氟虫腈的保留时间、定量离子、定性离子、碰撞能量（CE）、去簇电压（DP）等质谱参数见表1。

表1 氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜的质谱参数

2.4 样品前处理 新鲜鸡蛋去壳后搅拌均匀，鸡肉用粉碎机捣碎。称取2g试样（精确至0.01g）于50 ml离心管中,加入2.0ml水、10ml 1%（体积分数）甲酸乙腈溶液、20μl同位素内标工作溶液、涡旋振荡30min,以10000r/min于4°C离心10min,待净化。

取上层清液2ml过PRiME HLB柱，收集中间流出液于1.5ml离心管中,取0.5ml上述收集液，加入0.5ml水定容至1.0ml,过0.22μm PTFE有机微孔滤膜后，进样待测定。

3 结果与讨论

3.1 质谱与色谱条件的优化 各取30 μg/L的单标溶液，用流动注射泵直接注入质谱仪进行质谱参数的优化。由于在氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜的化学结构中存在强吸电子基团，分子较易失去氢质子，负离子模式质谱响应优于正离子模式，故采用负离子模式进行检测。

比较在乙腈-水、甲醇-水、乙腈-含0.1%（v/v）甲酸的水溶液、甲醇-含0.1%（v/v）甲酸的1 mmol乙酸铵水溶液、乙腈-含0.1%（v/v）甲酸的1 mmol乙酸铵水溶液为流动相体系下的峰形及质谱响应效果。结果表明：相同梯度下甲醇体系的分离效果更佳，在流动相中加入甲酸和乙酸铵有利于改善峰形，最终于采用甲醇-含0.1%（v/v）甲酸的1 mmol乙酸铵水溶液为本方法使用的流动相（见图2）。

图2 氟虫腈及其代谢物的色谱图

3.2 提取溶剂的选择 根据化合物的特性，选用甲醇、乙腈、1%（v/v）甲酸甲醇和1%（v/v）甲酸乙腈作为提取溶剂，在阴性样品中添加5.0 μg/kg混合标准溶液进行提取，内标法定量，考察提取回收率（见图3）。结果表明，以甲醇为提取液时，提取液浑浊且回收更低，乙腈具有更高的蛋白沉淀能力，提取液澄清；加入1%（v/v）甲酸可以减少基质效应，提高回收率，因此本研究选择1%（v/v）甲酸乙腈作为提取溶剂。

图3 不同溶剂提取对氟虫腈及其代谢物回收率的影响

3.3 净化方法的选择和基质效应的评价 动物源食品基质复杂，含有大量的脂肪、蛋白和不饱和脂肪酸，这些物质不仅干扰UPLC-MS/MS分析，还影响色谱柱柱效和污染质谱仪。鉴于本实验的目标提取液为高比例的有机相，采用通过式固相萃取技术净化样品，将样品提取液直接通过PRiME HLB柱，少量的水可使填料中亲水基团结构发生变化，能有效吸附基质干扰物。

为验证方法，以鸡蛋和鸡肉为研究对象，将采用PRiME HLB柱净化方式和直接提取的效果进行比较，评价两种方法的基质效应（ME）。ME为基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线的斜率的比值，比值越接近1，则基质效应越小。本实验用空白基质提取液配制浓度范围为0.05 μg/L～20 μg/L基质匹配标准溶液，同时用50%乙腈配制相同浓度的溶剂标准溶液，考察了氟虫腈及其代谢产物在鸡肉和鸡蛋中的基质效应，结果列于表2：采用PRiME HLB柱净化方式效果更佳，ME为0.894～0.992之间，不存在明显的基质效应。

表2 氟虫腈及其代谢物的线性、相关系数、ME、检出限及定量限

3.4 方法学验证 对氟虫腈及其代谢物质量浓度分别为0.05μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、、5μg/L、10μg/L、20 μg/L和氟虫腈同位素内标质量浓度为2 μg/L的系列混合工作液进行测定,以氟虫腈及其代谢物的定量离子峰面积和氟虫腈内标定量离子峰面积的比值为纵坐标（y），对应的质量浓度的比值为横坐标（x），绘制标准曲线。氟虫腈及其代谢物在0.05～20μg/L内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.999，以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）确定氟虫腈及其代谢物的LOD和LOQ分别为0.2μg/kg和0.7μg/kg。

在鸡蛋和鸡肉样品中分别添加0.5、5、20μg/kg的氟虫腈及其代谢物标准，按1.3节前处理，进行加标回收实验（n=6），结果表明：方法的平均加标回收率在88.2%～95.1%，RSD为3.3%～7.8%。见表3。

表3 氟虫腈及其代谢物的平均回收率和精密度

3.5 实际样品检测 采用本方法检测市售20批次鸡蛋和10批次鸡肉样品中的氟虫腈及其代谢物残留，结果显示，有4批次鸡蛋检出氟虫腈砜，含量为0.85～4.9 μg/kg，低于我国所规定的最大残留限量。

4 结论

本实验建立了同位素内标-液相色谱-串联质谱测定动物性食品中氟虫腈及其代谢物的定量分析方法。无需复杂样品前处理过程，采用通过式固相萃取净化，降低了基质干扰；同时采用同位素内标法定量，保证了方法的准确性，定量限和精密度能满足痕量分析。适用于大批量动物性食品中氟虫腈及其代谢产物的检测，为食品监管提供了技术支撑。