洛美利嗪调控小鼠巨噬细胞极化的机制研究*

唐慧瑢， 古丽再帕尔·托合尼亚孜， 陈东馨， 姜洪超， 赵文娟， 孙 磊， 钱 峰

（上海交通大学药学院细胞与治疗抗体工程研究中心，上海200240）

炎症反应是机体面对外来刺激产生的一种生理性自动防御反应，该过程有大量炎症因子和免疫细胞参与［1］。过度激活的炎症反应会释放大量炎症介质，影响器官功能，引发过敏反应和代谢紊乱等疾病，甚至会诱发肿瘤，严重危害人体健康［2］。目前临床上常用的抗炎药物主要包括甾体类化合物与非甾体类化合物，然而这些药物副作用及不良反应较多、选择性较低，因此尚无法完全满足临床用药需求，故亟需开发更多疗效良好、靶向明确的新型抗炎药物。

巨噬细胞是体内炎症反应过程中重要的细胞之一［3］，在不同刺激下，巨噬细胞的表型、功能及形态等都会发生不同的分化，称为巨噬细胞的极化［4-5］。巨噬细胞的极化在免疫应答中承担重要角色。在细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等活化因子介导下，巨噬细胞通常向M1型极化，分泌促炎因子，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β 等，同时表达诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），活化大量促炎信号［6］，对细胞外基质的降解与细胞凋亡有加速效果，进而调节Th1 型免疫应答［1，7-8］，促进炎症进一步发展［2，9-10］。而在 IL-4 等细胞因子介导下，巨噬细胞主要向M2 型分化，特征性表达几丁质酶3 样蛋白3（chitinase 3-like protein 3，CHI3L3/Ym-1）、Fizz-1（found in inflammatory zone-1）、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）等，抑制T 细胞过度增殖和活化［3，9］，并促进抗炎物质的分泌，调节Th2型免疫应答作用［3，9，11］。许多信号通路参与并介导巨噬细胞的极化和免疫应答过程。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路可以介导细胞内外刺激信号，普遍存在于生物体中，并参与不同炎症反应和炎性分子的表达和调控，对M1型巨噬细胞免疫应答具有重要调控作用［12-14］。而信号转导及转录激活蛋白6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）信号通路在IL-4 诱导的巨噬细胞中会发生活化，促使巨噬细胞释放抗炎细胞因子，表达一系列抗炎物质，进而介导M2 型巨噬细胞免疫反应［15］。一般认为抑制巨噬细胞促炎因子分泌或增加抗炎因子产生，调控免疫应答相关信号通路是抗炎药物发挥作用的重要环节。

洛美利嗪是二苯基哌嗪类新一代的钠、钙双通道拮抗剂，临床上广泛用于偏头痛的治疗［16］。有证据表明偏头痛患者体内可能存在神经源性炎症［17］，在家族遗传性偏瘫型的偏头痛转基因实验小鼠模型体内也检测到三叉神经节中有较高TNF-α、IL-6 和IL-1β 等促炎细胞因子的 mRNA 表达［18-19］，提示洛美利嗪作为高效低毒的偏头痛治疗药物，可能也具有一定的抗炎活性。然而关于洛美利嗪的抗炎活性和巨噬细胞极化的调控作用目前知之尚少，有待进一步的开发研究。

本研究中我们以LPS 和IL-4 体外刺激小鼠骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）和小鼠巨噬细胞株Raw 264.7，检测洛美利嗪对于巨噬细胞极化的影响，并探讨其可能机制。

材料和方法

1 主要材料

洛美利嗪（纯度大于99%）购于爱必信（上海）生物科技有限公司；DMEM 培养液、RPMI-1640 培养液、胰蛋白酶、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）和胎牛血清购于Thermo Fisher；100×青霉素/链霉素购自上海翌圣生物有限公司；Ym-1 抗体购于 STEMCELL；Fizz-1 抗体购于Abcam；p38 MAPK、p-p38 MAPK、细胞外信号调节激酶 1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、p-ERK1/2、c-Jun 氨基末端激酶 1/2（c-Jun N-terminal kinase 1/2，JNK1/2）、p-JNK1/2、iNOS、Arg-1、NF-κB p65、p-p65、NF-κB抑制因子α（NF-κB inhibitor α，IκBα）、STAT6、p-STAT6 和 β-actin 抗体购自Cell Signaling Technology；IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA试剂盒购于R&D；反转录试剂盒和实时荧光定量PCR检测试剂盒购于TOYOBO。

本实验中所用小鼠为 6～8 周龄、体重20～25 g 的SPF 级野生型C57BL/6小鼠（雌雄不限），购于上海实验动物中心（合格证：No.20180003000592），饲养于上海交通大学实验动物中心，环境湿度恒定为55%，温度恒定为25 ℃，光照为12 h循环，饮食及饮水均自由提供。所有实验操作均符合上海交通大学生物学研究伦理委员会及国立卫生研究院的相关规定。

2 主要方法

2.1 细胞培养 BMDM 所用培养液为含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM 培养液。取6～8周龄野生型小鼠，处死后分离后肢胫骨和股骨，在无菌环境内将骨髓冲出，加入10 μg/L M-CSF 培养3 d进行换液，补加M-CSF 继续培养2 d后可用于后续实验。Raw 264.7细胞购于中国科学院上海细胞库，所用培养液为含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640 培养液。细胞置于 37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。观察细胞状态，在细胞生长至对数生长期时，及时进行传代、接种和冻存。

2.2 RT-qPCR 对于M1 型极化实验，将状态良好的 BMDM 或 Raw 264.7 细胞以每孔 1×106接种至 6 孔板，过夜培养，共分为4组：对照组、LPS 刺激组、洛美利嗪和LPS 共刺激组以及小白菊内酯和LPS 共刺激组，待细胞长满约80%～90%时，在洛美利嗪和LPS共刺激组加入10 μmol/L 洛美利嗪预孵育0.5 h，在小白菊内酯和LPS 共刺激组，加入10 μmol/L 小白菊内酯预孵育0.5 h，随后在对照组以外的其他组加入100 μg/L LPS 刺激 6 h 后收样检测。对于 M2 型极化实验，将状态良好的BMDM 或Raw 264.7 细胞以每孔 1×106接种至6 孔板，过夜培养，共分为 3 组：对照组、IL-4 刺激组以及洛美利嗪和IL-4 共刺激组，待细胞长满约80%～90%时，在洛美利嗪和IL-4 共刺激组加入10 μmol/L 洛美利嗪预孵育0.5 h，随后在对照组以外的其他组加入10 μg/L IL-4 刺激6 h 后收样检测。使用Trizol 法提取细胞样本总RNA，使用Nano-Drop 2000 微量分光光度计进行RNA 定量。按照说明书完成反转录，获得模板cDNA。根据实时荧光定量PCR 检测试剂盒说明书进行实验，设置3 个复孔，求平均值，通过分析ΔΔCt值，进行定量计算，实验独立重复 3 次。以 2-ΔΔCt法测定相关分子的 mRNA 相对表达量。IL-6 的上游引物序列为5'-TACCACTTCACAAGTCGGAGGC-3'，下游引物序列为5'-CTGCAAGTGCATCATCGTTG-3'；IL-1β 的上游引物序列为5'-TGGACCTTCCAGGATGAGGACA-3'，下游引物序列为 5'-GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG-3'；TNF-α 的上游引物序列为5'-GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3'，下 游 引 物 序 列 为 5'-GCCATAGAACTGATGAGAGGGAG-3'；Arg-1 的上游引物序列为5'-CATTGGCTTGCGAGACGTAGAC-3'，下游引物序列为5'-GCTGAAGGTCTCTTCCATCACC-3'；Fizz-1 的上游引物序列为5'-GAACGCGCAATGCTCCTTTGAG-3'，下游引物序列为5'-AGCCACAAGCACATCCAGTGAC-3'；Ym-1 的上游引物序列为5'-AGAAGGGAGTTTCAAACCTGGT-3'，下游引物序 列 为 5'-CTCTTGCTGATGTGTGTAAGTGA-3'；GAPDH 的上游引物序列为5'-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3'，下游引物序列为5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3'。

2.3 Western blot 分析 将状态良好的BMDM 或Raw 264.7 细胞以每孔 1×106接种至 6 孔板，共分为 5组：对照组、单独（10 μg/L IL-4 或100 μg/L LPS）刺激组及 3、10 和 30 μmol/L 洛美利嗪预处理组。过夜培养，待细胞长满约80%～90%时，在洛美利嗪预处理组加入 3、10 和 30 μmol/L 洛美利嗪预孵育 0.5 h，随后在对照组以外的其他组内加入10 μg/L IL-4或100 μg/L LPS 刺激0.5 h 或24 h 后收样检测。弃去上清，将细胞培养板置于冰上，用预冷的PBS 沿壁轻轻清洗，将 PBS 吸净弃去，每孔加入 150 μL 1× loading buffer 后静置5 min，用细胞刮板将细胞充分裂解，并将裂解完全的细胞收集起来，金属浴加热10 min 后样品制备完成。将样品（上样量一般为7 μL）与Marker（2 μL）逐个加入至 10% SDS-PAGE 凝胶样品槽内；开始电泳用80 V 压胶待样品浓缩至平后再改用120 V，电泳至蓝色液条带到凝胶底部为止；电泳结束后，将样品从凝胶转移到NC 膜上。剪下比凝胶大小略大的NC 膜，在转膜缓冲液中操作，电压保持在110 V，时间90 min，冰水浴完成转膜。转膜完成后取出已带有蛋白样的NC膜放进5%脱脂牛奶中封闭1 h，在室温摇床上孵育。弃去牛奶，用1× TNET缓冲液洗去多余的牛奶，加入相对应的Ⅰ抗，放入4 ℃冰箱里的摇床上，慢摇，孵育过夜。回收Ⅰ抗溶液，1× TNET 缓冲液洗3 次膜，每次为7 min。加入带有HRP 标记的Ⅱ抗，室温摇床孵育2 h。1×TNET 缓冲液洗 3 次膜，每次 10 min；将 ECL 底物 A 与 B 以 1∶1混合，现配现用，尽量避光，用吸水纸吸干NC 膜上的残余液，膜上滴满配好的显影液，并用凝胶成像系统曝光成像。将曝光后的条带用ImageJ 软件进行分析，实验独立重复3次。

2.4 ELISA 分析 将状态良好的BMDM 或Raw 264.7 细胞以每孔 1×106接种至 6 孔板，过夜培养，共分为 4 组：对照组、LPS 刺激组、洛美利嗪和 LPS 共刺激组以及小白菊内酯和LPS 共刺激组。待细胞长满约80%～90%时，在洛美利嗪和LPS 共刺激组加入10 μmol/L 洛美利嗪预孵育0.5 h，在小白菊内酯和LPS共刺激组，加入10 μmol/L 小白菊内酯预孵育0.5 h，随后在对照组以外的其他组加入100 μg/L LPS 刺激24 h 后收集上清，用于检测细胞上清培养液中细胞因子的表达水平。提前1 天铺板，按照所需检测的量配制Capture Antibody（120 倍稀释），每孔加入0.1 mL，室温孵育过夜，第2 天弃去液体，用PBST 溶液洗3 遍，然后加入3%BSA 溶液，每孔加入0.2 mL，室温孵育2 h，弃去液体，PBST 溶液清洗3 遍，然后加入标准品和待测样品，每孔加入0.1 mL，室温孵育2 h，弃去液体，PBST溶液清洗3次，之后按照所需检测的量配制 Detection Antibody（60 倍稀释），每孔加入 0.1 mL，室温孵育 2 h，弃去液体，PBST 溶液清洗3 次，然后加入40 倍稀释的HRP 溶液，避光孵育1 h，然后弃去液体，PBST溶液清洗3次，随后加入底物缓冲液避光孵育20 min 后加入终止液，按说明书在特定的吸光度处进行检测，然后根据吸光度进行换算，实验独立重复3次。

3 统计学处理

应用GraphPad Prim 8.3软件进行数据处理和分析。实验数据均为至少3 次独立重复实验结果，并用均数±标准误（mean±SEM）表示。组间均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 洛美利嗪对巨噬细胞M1型极化的影响

本研究中以小白菊内酯（parthenolide）作为阳性药物，检测了洛美利嗪对LPS 诱导的巨噬细胞M1 型极化的影响。我们首先检测了LPS 刺激下BMDM 和Raw 264.7 细胞炎症因子 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的表达。结果显示了 LPS 刺激 6 h 后 BMDM 中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的 mRNA 水平显著升高（P＜0.01），而 10 μmol/L 洛美利嗪预处理显著抑制了BMDM 中TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的 mRNA 水平（P＜0.01），见图 1A。如 图 1B 所 示 ，LPS 刺 激 6 h 后 ，Raw 264.7 细 胞 中TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的 mRNA 水平升高，10 μmol/L洛美利嗪预处理显著抑制了Raw 264.7 细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平（P＜0.01）。

Figure 1.The effect of lomerizine on the inflammatory cytokine release of M1 macrophages.A：the mRNA expression levels of TNF-α，IL-6 and IL-1β in LPS-induced BMDM detected by RT-qPCR；B：the mRNA expression levels of TNF-α，IL-6 and IL-1β in LPS-induced Raw 264.7 cells detected by RT-qPCR.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs LPS group.图1 洛美利嗪对M1型巨噬细胞炎症因子产生的影响

同时对细胞上清液中细胞因子的分泌进行检测显示，LPS 诱导的 BMDM 及 Raw 264.7 细胞中细胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 分泌均可以被洛美利嗪抑制（P＜0.05），见图2。

Figure 2.The effect of lomerizine on the inflammatory cytokine secretion of M1 macrophages.A：the secretion of TNF-α，IL-6 and IL-1β in LPS-induced BMDM detected by ELISA；B：the secretion of TNF-α，IL-6 and IL-1β in LPS-induced Raw 264.7 cells detected by ELISA.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.图2 洛美利嗪对M1型巨噬细胞炎性细胞因子分泌的影响

为了检测LPS 刺激后洛美利嗪对巨噬细胞M1型极化标志物的影响，我们分别检测了LPS刺激24 h后BMDM 和Raw 264.7 细胞中iNOS 蛋白的表达水平。Western blot 实验结果显示，LPS 刺激 BMDM 和Raw 264.7 细胞24 h 后，iNOS 蛋白水平显著升高（P＜0.01）；3、10 和 30 μmol/L 洛美利嗪预处理巨噬细胞0.5 h 可剂量依赖性地下调iNOS 的蛋白水平（P＜0.01），见图3。

Figure 3.The effect of lomerizine on expression of M1 polarization marker in macrophages.A：the protein level of iNOS in LPS-induced BMDM detected by Western blot；B：the protein level of iNOS in LPS-induced Raw 264.7 cells detected by Western blot.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.图3 洛美利嗪对巨噬细胞M1型极化标志物的影响

2 洛美利嗪对巨噬细胞M2型极化的影响

为了进一步探究洛美利嗪抗炎活性，我们随后检测了洛美利嗪对巨噬细胞M2 型极化的影响。用IL-4 刺激 BMDM 6 h 后，与 IL-4 处理组相比，10 μmol/L 洛美利嗪预处理能够显著增加M2 型极化标志物Arg-1、Fizz-1 和 Ym-1 的 mRNA 表达水平（P＜0.01），见图 4A。用 IL-4 刺激 Raw 264.7 细胞 6 h 后，与IL-4处理组相比，10 μmol/L 洛美利嗪预处理显著上调了M2 型极化标志物 Arg-1、Fizz-1 和 Ym-1 的 mRNA 表达水平（P＜0.05），见图4B。

Figure 4.The effect of lomerizine on the mRNA expression of M2 polarization markers in macrophages.A：the mRNA expression of Ym-1，Arg-1 and Fizz-1 in IL-4-induced BMDM detected by RT-qPCR；B：the mRNA expression of Ym-1，Arg-1 and Fizz-1 in IL-4-induced Raw 264.7 cells detected by RT-qPCR.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs IL-4 group.图4 洛美利嗪对巨噬细胞M2型标志物mRNA表达的影响

Western blot实验结果显示不同浓度的洛美利嗪预处理两种巨噬细胞后，M2 型极化标志物Arg-1、Fizz-1和Ym-1的蛋白水平随着洛美利嗪浓度的增加而上调（P＜0.05），见图5。

Figure 5.The effect of lomerizine on the protein expression of M2 polarization markers in macrophages.A：the protein levels of Ym-1，Arg-1 and Fizz-1 in LPS-induced BMDM detected by Western blot；B：the protein levels of Ym-1，Arg-1 and Fizz-1 in LPS-induced Raw 264.7 cells detected by Western blot.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs IL-4 group.图5 洛美利嗪对巨噬细胞M2型极化标志物蛋白表达的影响

3 洛美利嗪通过MAPK 和NF-κB 信号通路调控巨噬细胞极化

接下来我们检测了洛美利嗪是否通过调控MAPK、NF-κB 和 STAT6 信号通路介导巨噬细胞极化。结果显示，洛美利嗪能够剂量依赖性地降低LPS诱导的巨噬细胞中 p38 MAPK、ERK1/2、JNK1/2 和NF-κB p65 的磷酸化水平（P＜0.01），同时显著增加IκBα 的表达（P＜0.01），见图6A、7A。此外，洛美利嗪对IL-4 诱导的STAT6 磷酸化无显著影响，见图6B、7B。

Figure 6.The effect of lomerizine on MAPK and NF-κB signaling pathways（A）and STAT6 signaling pathway（B）in BMDM.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.图6 洛美利嗪对BMDM 中MAPK、NF-κB和STAT6信号通路的影响

Figure 7.The effect of lomerizine on MAPK and NF-κB signaling pathways（A）and STAT6 signaling pathway（B）in Raw 264.7 cells.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.图7 洛美利嗪对Raw 264.7细胞中MAPK、NF-κB和STAT6信号通路的影响

讨 论

洛美利嗪是二苯基哌嗪类的非甾体类新一代钠、钙双通道拮抗剂。与同类药物相比，它可以选择性的扩张血管，作用时间长，对脑缺血和脑缺氧起到保护作用，而且无锥体外系副作用，临床上普遍应用于偏头痛的治疗［20-21］。有研究表明偏头痛与神经源性炎症有密切的联系，提示了洛美利嗪有潜在的抗炎活性［16，18，20］。本研究中检测到洛美利嗪可以显著降低M1型巨噬细胞炎症因子的表达，表明洛美利嗪在外周也能发挥抗炎作用，调节巨噬细胞免疫应答，这为洛美利嗪的老药新用开辟了新思路。目前关于洛美利嗪的研究主要集中在其神经保护作用方面，包括对氧化应激引起的神经毒性［22］和记忆损伤［23］、视神经损伤［24-25］以及阵发性眩晕［26］的恢复作用等。然而关于洛美利嗪对免疫细胞如巨噬细胞的调节作用尚未有深入探究，脑内存在的小胶质细胞与巨噬细胞在功能上有许多类似之处，小胶质细胞在脑内炎症反应中同样具有重要调控作用。本研究的结果表明洛美利嗪可能也能够影响神经炎症反应和小胶质细胞功能，提示洛美利嗪的适应证可能并不局限于此。

巨噬细胞在外界刺激下会发生极化，表型、形态及功能发生改变，显著增加其吞噬和杀伤能力［8］，同时释放大量细胞因子，触发炎症反应。巨噬细胞受到LPS 刺激后通常向M1 型极化，并释放大量炎症因子，加剧炎症反应［27］。iNOS 是调控 NO 产生的 M1 型巨噬细胞中特征性酶［28］。IL-4 刺激巨噬细胞后则会促进其抗炎因子表达并向M2型极化［1，29］。本研究检测到洛美利嗪在体外不仅能够降低巨噬细胞炎症因子产生并下调iNOS 的表达，还能够促进巨噬细胞M2 型标志物的表达。洛美利嗪对巨噬细胞极化的双重作用揭示其具有良好的抗炎活性。

NF-κB 是炎症早期的重要调节因子，介导许多不同的免疫反应和相关基因的表达调控［30］，诱导IL-1β、IL-6 和TNF-α 等促炎细胞因子的转录和表达，放大炎症信号。由于活化NF-κB 亚基的组成存在着两种形式，即促炎的p65/p50 M1 型和抗炎的p50/p50 M2 型，使得NF-κB 信号通路在巨噬细胞不同应答模式下发挥不同作用［31-32］。MAPK 也是 LPS 诱导巨噬细胞活化的重要信号通路之一，可以激活JNK、ERK和p38 MAPK等亚群，然后再作用于各自的配体和底物，调节多种转录因子的表达［33-34］。此外也有研究显示 MAPK 信号通路能参与巨噬细胞 M1/M2 转化［35］。STAT6 是IL-4 介导的信号转导通路中的重要信号分子，而STAT6 与Th2 细胞介导的免疫反应期间M2 巨噬细胞激活有关，可以促进巨噬细胞释放抗炎因子，从而发挥抗炎作用［3，15］。小白菊内酯作为经典的抗炎化合物，普遍认为可以有效抑制LPS 诱导的M1 型巨噬细胞炎症因子表达［36］，且有证据证明其对NF-κB 和 MAPK 信号通路具有调控作用［36-37］，尚无研究显示小白菊内酯能够促进巨噬细胞M2 型极化。本研究结果显示洛美利嗪也可以抑制NF-κB 和MAPK信号通路过度活化，但其对IL-4/STAT6 的活化无显著影响。Ca2+作为细胞内第二信使之一，调节很多重要的生理过程［38］。LPS 被证明可以促发小鼠巨噬细胞胞浆中的钙离子流，进而诱导炎症因子产生［39-41］。我们推测洛美利嗪作为一种非选择性的钙通道拮抗剂，可能通过作用于钙通道蛋白，减少LPS 刺激下巨噬细胞胞内Ca2+的浓度进而影响下游信号NF-κB 和MAPK通路，从而抑制M1型巨噬细胞极化，而STAT6信号通路可能不受其影响。

在本研究中，我们检测到洛美利嗪能够抑制抑制巨噬细胞M1 型极化以及促进M2 型极化，其机制可能与调控MAPK 信号通路中p38 MAPK、ERK1/2、JNK1/2 的活化和 NF-κB 信号 通 路中 NF-κB p65、IκBα的活化及表达有关。