藏红花酸对异丙肾上腺素诱导心肌梗死大鼠心脏功能的保护作用

张蔚丽，宋秀荣，王晓敏，李晓琼，王义华，宋明星，李 猛

冠心病在我国心血管病中占据较高的比例，而急性心肌梗死则是冠心病中最为严重的疾病，因其致死、致残率高，突发性强，成为公共卫生中需要积极预防的一类疾病。以往的研究中常常需要建立动物的心肌梗死模型，以便于研究心肌梗死的病理生理过程。目前经常使用腹腔注射人工合成的β肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)来建立动物心肌梗死模型[1]。有文献报道，异丙肾上腺素介导的大鼠心肌梗死模型与人类心肌梗死的形态学和病理生理特征表象相一致[2]。藏红花(Iridaceae)又名番红花或西红花，是一种属于鸢尾科多年生无茎草本植物，广泛分布于中亚、西亚以及地中海等地区，后经丝绸之路传入我国西藏，故名藏红花。研究表明，藏红花及其活性成分具有多种功能[3]，包括神经保护功能[4]、抗惊厥[5]、抗抑郁[6-7]、抗支气管扩张[8]和抗肿瘤作用[9-12]。据报道藏红花酸可以减少雄性白化病大鼠的脂质过氧化[13]，减少骨骼肌和大脑海马体中缺血-再灌注介导的氧化应激损伤[14]。有报道证实藏红花酸具有自由基清除活性[15]。但藏红花酸对急性心肌梗死的作用及其相关机制报道较少。本研究旨在探讨心肌梗死时藏红花酸预处理能否有效减轻心肌细胞损害，对抗炎性反应，保护心脏功能，维护血流动力学稳定。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验采用由北京维通利华实验动物技术有限公司提供的无特定病原体(SPF)级健康雄性Wister大鼠50只，体质量200～220 g，动物质量合格证编号：SCXK20140009。所有实验动物严格按照标准条件饲养1周后用于相关实验。

1.2 试剂 本研究中所使用的化学试剂和生化试剂均为分析级和最高纯度。异丙肾上腺素(批号：15627，Sigma Aldrich.，St.Louis，USA)、藏红花酸(批号：S0371，Sigma Aldrich.，St.Louis，USA)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)检测试剂(批号：20161222)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)检测试剂(批号20161222)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)检测试剂(批号：20161334)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)检测试剂(批号：20161336)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)检测试剂(批号：20161338)均由武汉贝茵莱生物科技有限公司提供。

1.3 动物模型制备 将50只大鼠随机分为5组(采用Excel软件随机生成相应的数字)：对照组、心肌梗死组、藏红花酸50 mg/(kg·d)组、藏红花酸100 mg/(kg·d)组、藏红花酸200 mg/(kg·d)组，每组10只。藏红花酸50 mg/(kg·d)组、藏红花酸100 mg/(kg·d)组、藏红花酸200 mg/(kg·d)组大鼠予以相应剂量藏红花酸灌胃，对照组与心肌梗死组予以等量的生理盐水灌胃，每日1次，连续15 d。在第14天和第15天给予心肌梗死组和藏红花酸各剂量组连续2 d皮下多点注射异丙肾上腺素[90 mg/(kg·d)]建立心肌梗死模型，对照组予以等量的生理盐水多点皮下注射。在第2次腹腔注射异丙肾上腺素24 h后，将大鼠予以戊巴比妥麻醉(60 mg/kg，皮下注射)，然后固定于固定板上，监测大鼠心电图(走纸速度50 mm/s，振幅1 mV/mm)，记录大鼠平静后5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min的心电图，分析大鼠心电图ST段的变化情况，以出现病理性Q波和/或ST段位移大于0.2 mV作为心肌梗死建模成功的标志[16]。

1.4 左室血流动力学的测定 成功描记心电图后24 h，将所有实验组大鼠用戊巴比妥(60 mg/kg)腹膜内麻醉。阿托品(4 mg/kg)与麻醉剂一起施用以维持心率，特别是在手术期间可减少气管-支气管分泌物。用中线正中切口打开颈部进行气管切开术。使用正压呼吸机(SuperV，深圳徕越生物技术有限公司生产)将室内空气压缩，以90次/min的速率和10 mL/kg的潮气量对大鼠进行通气，根据需要调整呼吸机设置和血氧分压(PO2)，将动脉血气参数保持在生理范围内。左颈静脉插入聚乙烯管以连续输注生理盐水。用肝素化-生理盐水灌注套管插入右颈动脉。使用压力传感器将套管与生物机能实验系统(MD3000/8型，徐州利华电子科技发展有限公司生产)连接，并且借助放大器放大信号以测量收缩压、舒张压、平均动脉压和心率。经左侧第4肋、第5肋间行左侧胸廓切开术，暴露心脏。切开心包后，通过在肋骨上轻轻按压使心脏裸露在外。无菌金属套管(1.5 mm孔径)经心尖部区域插入左心室，用以检测左心室血流动力学，包括左心室压力最大上升速率(+LVdp/dtmax)、左心室压力最大下降速率(-LVdp/dtmax)及左室舒张末压力(LVEDP)。通过多通道记录仪(MD8000N，安徽正华生物仪器设备有限公司生产)上的压力记录导管将套管连接至压力传感器。在10 min的稳定时间之后，在不同的标准化灵敏度和速度下于基线测量后在记录纸上记录描记线。手术后，用生理盐水浸泡敷料覆盖胸腔，以防止心脏干燥。各数值均为连续10次心脏搏动的平均值。

1.5 生化参数的测定 所有实验大鼠在完成左室血流动力学检测后，均采取拉颈处死。分离每只大鼠的心脏，制备大鼠心肌组织匀浆，采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)测定LDH、CK-MB、IL-β、IL-6、TNF-α含量，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，使用酶标仪(HBS-1096C，南京德铁实验设备有限公司生产)在450 nm处测定吸光度(OD)值。使用试剂标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程，将大鼠心肌细胞匀浆的OD值代入回归方程，计算出标本样品浓度，之后乘以稀释倍数，得出标本的实际浓度。

1.6 心肌组织病理 采用Ojha等[17]的方法对心脏组织进行组织病理学研究。用甲醛保存固定分离的心脏，之后加入液体石蜡中制备蜡块。使用切片机将大鼠心肌组织切成4 μm的标本，并将标本固定于玻片上。采用苏木素-伊红(HE)染色法对组织进行染色，用三目显微镜对组织进行观察。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况 造模前各组大鼠外观基本一致。给予藏红花酸及生理盐水灌胃后，各组大鼠一般情况一致。皮下注射异丙肾上腺素2 d后，心肌梗死组及藏红花酸各剂量组大鼠出现精神不振、毛发欠光泽、食量减少、懒动等表现，对照组大鼠无明显变化。

2.2 各组大鼠左心室功能比较 心肌梗死组±LVdp/dtmax较对照组明显降低(P<0.01)，LVEDP较对照组明显升高(P<0.01)；与心肌梗死组相比，藏红花酸各剂量组+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax明显提高，LVEDP明显降低(P<0.05或P<0.01)，且呈现剂量依赖性。详见表1。

表1 各组大鼠左心室功能比较(±s)

2.3 各组大鼠心脏血流动力学指标比较 与对照组比较，心肌梗死组平均动脉压、舒张压、收缩压和心率均明显降低(P<0.01)；与心肌梗死组比较，藏红花酸各剂量组平均动脉压、舒张压、收缩压和心率均提高(P<0.05或P<0.01)，且呈剂量依赖性。详见表2。

表2 各组大鼠心脏血流动力学指标比较(±s)

2.4 各组大鼠心肌损伤标志物水平比较 与对照组比较，心肌梗死组心肌组织匀浆中心肌损伤的生物标志物CK-MB、LDH浓度降低；与心肌梗死组比较，藏红花酸各剂量组心肌组织匀浆中CK-MB、LDH浓度明显升高(P<0.05或P<0.01)，并且呈现剂量依赖性。详见表3。

表3 各组大鼠心肌损伤标志物水平比较(±s) 单位：U/L

2.5 各组大鼠心肌细胞炎症介质水平比较 与对照组比较，心肌梗死大鼠心肌组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度明显增高(P<0.01)；与心肌梗死组比较，藏红花酸各剂量组心肌组织匀浆中IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。详见表4。

表4 各组大鼠心肌细胞炎症介质水平比较(±s) 单位：ng/L

2.6 各组大鼠心肌组织细胞结构 本研究观察了大鼠心肌梗死后以及藏红花酸处理后心肌组织的镜下形态学表现，对照组心肌细胞排列整齐，细胞无明显水肿、损伤、炎性细胞浸润等表现；心肌梗死组心肌细胞可以看到组织坏死、白细胞浸润、间隙性水肿和血管改变等表现，而在经过藏红花酸处理过的心肌细胞中，这种病理性改变明显减轻，而且也表现出一定的剂量依赖的特点。详见图1。

3 讨 论

冠心病急性心肌梗死以其突发性强、致死致残率高而成为威胁人们身体健康的头号杀手。研究表明，过量注射异丙肾上腺素可以在心肌组织中引起严重的应激反应、钙超载、炎症反应加剧、脂质过氧化物堆积等[18-19]，导致梗死样心肌坏死。异丙肾上腺素诱导的心肌梗死与人类心肌梗死的病理过程极为相似，可以作为研究药物和心肌梗死后心脏功能变化的良好的标准化模型[2，20]。本研究给予大鼠腹腔大剂量注射异丙肾上腺素24 h后检查心电图可以观察到病理性Q波和ST-T心肌损害图形，提示造模成功。

本研究结果表明，当实验大鼠大剂量腹腔注射异丙肾上腺素后，大鼠发生急性心肌梗死，其直接后果是导致大鼠的心脏功能急剧下降，与对照组相比，心肌梗死组+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax明显降低，LVEDP明显升高，收缩压、舒张压、平均动脉压均明显降低，提示大鼠心肌严重受损，导致大量心肌细胞功能丧失，心肌收缩力明显下降，回心血量增加而血液泵出心室的能力下降。而经过藏红花酸预处理的实验大鼠，其心脏功能的各项指标均改善，而且呈现出一定的剂量依赖性，表明藏红花酸能够明显降低心肌梗死大鼠心功能的恶化程度、稳定心肌梗死大鼠的血流动力学、改善心肌梗死的预后[21-22]。

为了解藏红花酸改善心肌梗死大鼠心脏功能的具体机制，本研究进一步检测了大鼠心肌细胞匀浆的心肌酶、炎性介质的含量，并且观察了大鼠心肌细胞的组织病理学标本。CK-MB、LDH常常被定义为一种敏感、特异的心肌损伤生物标志物[23]，当心肌细胞损伤破裂后，细胞浆内的酶释放入血导致血浆中酶学升高。本研究检测了大鼠心肌细胞匀浆中的CK-MB、LDH浓度，结果表明，心肌梗死组的心肌细胞匀浆中CK-MB、LDH浓度明显低于对照组，提示心肌梗死发生后，心肌细胞受损，细胞膜通透性改变，甚至功能丧失，致使胞质中的CK-MB、LDH释放入血，导致细胞匀浆中的酶含量减少。而经藏红花酸处理的各组大鼠心肌细胞匀浆中CK-MB、LDH浓度升高，且存在一定的剂量依赖性，提示藏红花酸具有稳定心肌细胞膜的作用[24]，在急性缺血、缺氧损害时，经过藏红花酸预处理的心肌细胞能够更好地保存功能，减轻细胞损伤。

在异丙肾上腺素诱导的心肌梗死中，炎症反应的损伤也起到了重要的作用。本研究检测了炎症介质IL-1β、IL-6和TNF-α，可见心肌梗死组IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子水平明显高于对照组(P<0.01)，而藏红花酸预处理后的大鼠心肌梗死细胞的炎症介质水平明显降低(P<0.05或P<0.01)，且存在一定的剂量依赖。当发生急性心肌梗死时，细胞因子如TNF-α等通过肥大细胞脱颗粒释放，肥大细胞释放的其他因子如组胺、5-羟色胺等直接或通过刺激其他细胞因子如 IL-6的释放参与对缺血的炎症反应[25-26]，细胞因子如 TNF-α、白细胞介素-1(IL-1)、IL-6、白细胞介素-8(IL-8)、中性粒细胞活化肽-1 (NAP-1)、血小板活化因子(PAF)和巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)等细胞因子又刺激嗜中性粒细胞，心肌中细胞因子的产生在转录水平上由核因子-κB(NF-κB)调节，NF-κB由细胞因子本身或活性氧(ROS)激活[27]。藏红花酸可抑制肝脏中TNF-α、IL-1和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表达[25]，还可以抑制脂多糖(LPS)诱导的细胞释放一氧化氮(NO)，减少LPS刺激的肿瘤坏死因子、IL-1和细胞内ROS的产生，有效地降低LPS诱导的NF-κB活化。另外，藏红花酸还可以减少由干扰素和淀粉样蛋白刺激的小胶质细胞释放NO[28-30]。这些作用均可以减轻心肌梗死细胞的炎症反应，保护缺血的心肌。

通过心肌细胞病理检测可见，经过藏红花酸预处理的大鼠，心肌细胞的损伤程度明显降低，细胞的完整性更好，相应的心肌细胞中的心肌损伤标志物释放入血减少，急性炎症反应被抑制，有助于保护心脏功能，稳定血流动力学。

综上所述，藏红花酸能通过抑制炎性介质释放，减轻心肌细胞的损伤程度，从而维护心脏功能及稳定血流动力学，说明藏红花酸可能具有潜在的心血管保护作用。