甘薯抗草甘膦生理指标及其相关基因EPSPS和AKR的表达

柴沙沙,李成阳,雷 剑,王连军,刘巧林,杨新笋

(湖北省农业科学院 a粮食作物研究所/湖北省甘薯工程技术研究中心/粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室,b经济作物研究所，湖北 武汉 430064)

甘薯是一种重要的粮食、饲料及工业原料作物，作为一种新型能源作物，其地位十分重要。甘薯在茎叶封垄之前，田间杂草严重影响其幼苗生长，可引起甘薯减产5%～15%，草害严重时减产达50%以上，给甘薯生产带来重大损失[1]。在甘薯大规模生产中中耕除草耗费人力物力。目前选用合适的除草剂是最经济有效的除草方法[2]。草甘膦是一种非选择性、叶面施用的除草剂，由于具有广谱、低毒、低土壤残留的特点，主要用于防治一年生、二年生和多年生杂草，如莎草和阔叶杂草，主要作用部位是植物的茎和叶片[3-5]。

5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)是植物和大部分微生物体内莽草酸途径的一个关键酶，在芳香族氨基酸的生物体合成中至关重要[6]。草甘膦会专一抑制EPSPS活性，导致莽草酸大量积累，从而扰乱生物体正常的氮代谢而致其死亡。初步研究发现，喷施草甘膦会加剧甘薯叶片膜脂过氧化程度，提高叶片的CAT活性和MDA含量[2]。醛酮还原酶(aldo-ketoreductase,AKR)是一个包括14个家族共40个成员的超家族，广泛分布于原核生物和真核生物中[7-9]。AKR成员均属于单体胞质蛋白，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作为其辅酶，将醛酮类化合物还原成相应的醇类，在生物体中发挥重要作用[10-13]。Pan等[14]研究发现，水稻愈伤组织和幼苗对草甘膦的抗性表现为EcAKR4-1过表达和AKR活性增强。研究表明，AKR及其同工酶可能参与细胞生长和分化调控[15]，以及调节渗透作用、细胞中有毒物质的代谢等[6,16]。脯氨酸作为渗透调节物质，在植物体内具有重要的渗透调节作用。在逆境条件下植物体内脯氨酸含量显著增加[17]。原向阳等[18]研究表明，喷施草甘膦后，大豆脯氨酸含量升高，且脯氨酸含量与草甘膦剂量呈显著正相关。甘薯耐草甘膦是否与EPSPS和AKR基因的过表达有关尚不清楚。为此，本研究选取对草甘膦敏感性不同的2个甘薯品种N3589(草甘膦敏感型品种)和鄂薯11(草甘膦抗性品种)为试验材料，研究喷施草甘膦后甘薯莽草酸和脯氨酸含量及根系活力的变化，以及EPSPS与AKR基因的表达特点，为甘薯耐草甘膦分子机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为草甘膦抗性甘薯品种鄂薯11和草甘膦敏感型甘薯品种N3589(亲本为宁紫8号，集团杂交材料)。供试药剂为41%草甘膦异丙胺盐水剂(有效浓度2.16 mol/L，美国孟山都公司生产)。

1.2 试验设计

1.2.1 田间试验 试验于2019年5-10月在湖北省农业科学院粮食作物研究所鄂州试验基地进行。试验地土壤质地为壤土，0～20 cm土层土壤基础肥力情况：有机质含量26.3 g/kg，碱解氮含量185.06 mg/kg，速效磷(P)含量20.8 mg/kg，速效钾(K)含量304.05 mg/kg。

试验采用裂区试验设计，主区为不喷施草甘膦处理(A1)和喷施草甘膦处理(A2)，其中A1为喷施清水对照；A2喷施21.6 mmol/L草甘膦，即将41%草甘膦异丙胺盐水剂稀释100倍。副区为草甘膦抗性甘薯品种鄂薯11和草甘膦敏感型甘薯品种N3589。每个处理设3次重复，小区长5 m，宽4.8 m；株距25 cm，行距80 cm。栽插后20 d对甘薯进行喷施草甘膦处理，草甘膦溶液用量225 L/hm2，用喷雾器进行均匀喷雾，以叶面开始有液滴滑落时为准。甘薯于2019年5月20日栽插，10月22日收获，大田管理除了不进行中耕除草外，其他管理同田间生产。

1.2.2 盆栽试验 盆栽试验为研究喷施草甘膦之后，甘薯生长前期根系特性的辅助试验。盆栽试验处理同田间试验。选用高25 cm、上下内直径分别为23 cm和20 cm的硬塑料盆，填装大田耕层土壤，每盆装土6 kg。取3叶1心的甘薯幼苗，移栽于硬塑料盆中，每盆1株，每处理15盆。喷施清水对照和草甘膦处理的盆栽分开摆放，不同处理的盆栽排列间留一排为隔离。移栽后20 d，向甘薯叶面均匀喷施草甘膦除草剂，以叶面开始有液滴滑落时为准，草甘膦溶液浓度21.6 mmol/L，施用量为225 L/hm2。

1.3 取样方法

田间试验中设置专门的取样区, 分别于喷药后第2，5，8，11天，在取样区取3～5株,将整株植株分地上部与地下部2部分，其中地上部分将叶与茎分别称质量并留样，地下部分将直径≥0.5 cm的块根称质量并留样，110 ℃杀青，70 ℃烘干留样用于脯氨酸含量的测定。同时, 每个处理取5片功能叶(顶5叶)，液氮速冻，-20 ℃低温保存，用于莽草酸含量的测定。

盆栽试验中，分别于喷药后第2，5，8，11天冲根取样, 每个处理冲根 6盆，共取 6株, 用于根系活力测定。同时, 每个处理取5片幼嫩叶片，液氮速冻，-80 ℃超低温保存，用于实时荧光定量PCR(q-PCR)检测基因表达。

1.4 生理指标和根系活力的测定

莽草酸含量测定：采用分光光度法[19]并稍做改动：准确称取甘薯功能叶 0.1 g，剪碎于研钵中研磨，然后加入1 mL 0.25 mol/L HCl匀浆，4 ℃离心(12 000 r/min，15 min)，上清液置冰上待测。取上清液200 μL，加入2 mL 1%过碘酸溶液，混匀，室温静置3 h后再加入2 mL 1 mol/L的NaOH溶液和1.2 mL 0.1 mol/L甘氨酸，混匀静置5 min，于380 nm处测定吸光度(OD)。根据莽草酸标准曲线计算甘薯叶片中莽草酸含量。

脯氨酸含量测定：脯氨酸含量测定采用水浴浸提法[17]。

根系活力测定：根系活力测定采用TTC法[20]。

1.5 耐草甘膦相关基因表达检测

1.5.1 叶片总RNA的提取和cDNA合成 取冻存的幼嫩叶片经液氮研磨后，选用TransZol Up试剂盒(全式金生物技术有限公司) 进行总RNA提取。选用全式金生物技术有限公司的目录号为AT341-01的试剂盒进行反转录，反转录后的cDNA保存在-20 ℃冰箱。

1.5.2 引物设计 通过Sweetpotato GARDEN 网(http://sweetpotato-garden.kazusa.or.jp/)和Sweet-potato Genomics Resource网(http://sweetpotato.plantbiology.msu.edu/)获得EPSPS和AKR基因序列，采用Premier3 Plus设计基因的实时荧光定量分析引物，目前已经从甘薯中克隆到5条有序列差异的AKR基因(Itr_sc000139.1_g00024.1，Itr_sc000203.1_g00031.1，Itr_sc000691.1_g00020.1，Itr_sc000862.1_g00011.1，Itr_sc001070.1_g00006.1)，为将基因表达完全，分别设计2条引物AKR-1(Itr_sc000112.1_g00002.1)和AKR-2(Itr_sc000387.1_g00025.1)(表1)。内标基因甘薯肌动蛋白基因(β-actin)的检测引物参照杨元军等[21]的方法合成。

表1 试验相关基因引物Table 1 Primers used in this experiment

1.5.3 实时荧光定量分析 实时荧光定量PCR检测的荧光染料为SYBR Green(厦门致善生物科技有限公司)，PCR热循环仪是Bio-Rad CFX 384，所用软件为Bio-Rad CFX Manager。反应体系为:cDNA模板1.0 μL，引物-F(10 μmol/L) 0.4 μL，引物-R (10 μmol/L) 0.4 μL，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10.0 μL，Nuclease-free Water 8.2 μL，反应体系总体积为20 μL。两步法实时荧光定量PCR扩增反应条件为：94.0 ℃预变性2 min，94.0 ℃变性5 s，60.0 ℃退火30 s，45个循环；熔合曲线反应温度为65～95 ℃；每个样品设3个重复及NTC对照。反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线[14]。目的基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法进行相对定量[22]。

1.6 数据分析

试验数据的方差分析采用DPS处理，用Excel制图。

2 结果与分析

2.1 喷施草甘膦对甘薯叶片莽草酸含量的影响

由图1可以看出，喷施草甘膦之后第2天和第5天，2个甘薯品种叶片的莽草酸含量处理A2均高于对照处理A1，与草甘膦敏感型品种N3589相比，草甘膦抗性品种鄂薯11 A2处理的叶片莽草酸含量升高不明显。喷施草甘膦后第8天和第11天，草甘膦敏感型品种N3589处理A2的叶片莽草酸含量迅速下降，略高于处理A1；鄂薯11处理A2的莽草酸含量略有下降，但也略高于对照A1。由此可知，喷施草甘膦后，敏感型材料N3589的莽草酸迅速积累，而抗性品种鄂薯11的莽草酸积累较少。

图1 喷施草甘膦后甘薯叶片莽草酸含量的变化Fig.1 Changes of shikimic acid content in sweet potato leaves after spraying glyphosate

2.2 喷施草甘膦对甘薯脯氨酸含量的影响

由图2和图3可以看出，喷施草甘膦之后，草甘膦敏感型甘薯品种N3589叶片和块根的脯氨酸含量先升高后降低，最大值出现在喷施后第5天；草甘膦抗性品种鄂薯11叶片和块根的脯氨酸含量表现为先升高后降低又略微升高的趋势，最大值也出现在喷施后第5天。无论是敏感型品种N3589还是抗性品种鄂薯11，喷施草甘膦之后，叶片和块根中脯氨酸含量都显著升高。由此可见，与对照相比，喷施草甘膦之后，甘薯叶片和块根的脯氨酸含量均显著升高。

图2 喷施草甘膦后甘薯叶片脯氨酸含量的变化Fig.2 Changes of proline content in sweet potato leaves after spraying glyphosate

图3 喷施草甘膦后甘薯块根脯氨酸含量的变化Fig.3 Changes of proline content in sweet potato tuber after spraying glyphosate

2.3 喷施草甘膦对甘薯根系活力的影响

由图4可以看出，喷施草甘膦之后，2个甘薯品种处理A2的根系活力都是先升高后降低，最大值都出现在喷施草甘膦之后第5天，与喷施清水对照处理A1的变化趋势一致。与喷施清水对照处理A1相比，2个甘薯品种处理A2的根系活力均降低，一直到喷施草甘膦之后第11天，与对照A1相比，2个甘薯品种喷施草甘膦处理A2的根系活力差距减小。说明，无论敏感型还是抗性甘薯品种，喷施草甘膦之后，甘薯的根系活力均显著降低；而喷施草甘膦11 d后根系活力有所恢复。

图4 喷施草甘膦后甘薯根系活力的变化Fig.4 Changes of sweet potato root vigor after spraying glyphosate

2.4 甘薯耐草甘膦相关基因的表达

2.4.1EPSPS基因的表达 由图5可以看出，喷施草甘膦之后，草甘膦敏感品种N3589的EPSPS基因表达显著下调，而草甘膦抗性品种鄂薯11的EPSPS基因表达显著上调。说明，喷施草甘膦后EPSPS基因是否上调表达，可以作为植物是否耐草甘膦的标志。

图柱上标不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。下同Different lowercase letters indicate significant differences among treatments(P<0.05).The same below图5 喷施草甘膦后甘薯叶片EPSPS基因相对表达水平Fig.5 Relative expression levels of sweet potato EPSPS gene after spraying glyphosate

2.4.2AKR基因的表达 由图6和图7 可以看出，相较于对照(A1)，喷施草甘膦处理(A2)的AKR-1和AKR-2基因的相对表达有较为相似的变化规律。在喷施草甘膦之后第2天，草甘膦敏感品种N3589的AKR基因均表达上调；第5天，AKR-1基因下调表达，AKR-2基因上调表达；第8天以及第11天，AKR基因均显著下调表达。对于草甘膦抗性品种鄂薯11，喷施草甘膦后第2天，AKR基因表达显著下调；之后，均上调表达。说明，喷施草甘膦之后，敏感品种的AKR基因先上调表达后下调表达，而抗性品种的AKR基因先下调表达后上调表达。

图6 喷施草甘膦后甘薯叶片AKR-1基因相对表达水平Fig.6 Relative expression levels of sweet potato AKR-1 gene after spraying glyphosate

图7 喷施草甘膦后甘薯叶片AKR-2基因相对表达水平Fig.7 Relative expression levels of sweet potato AKR-2 gene after spraying glyphosate

3 讨 论

3.1 喷施草甘膦后甘薯生理指标的变化

脯氨酸在植物体内起到重要的渗透调节作用。在逆境条件下，植物体内的脯氨酸含量显著增加，在一定程度上反映了植物的抗逆性[17]。原向阳等[18]研究表明，喷施草甘膦后大豆脯氨酸含量升高，且与草甘膦剂量呈显著正相关。本研究结果显示，喷施草甘膦后甘薯叶片和块根的脯氨酸含量均升高，这与前人研究结果一致。草甘膦引起植物产生各种生理胁迫或氧化胁迫，其中最明显的症状是抑制植物的生长。根系活力是指根的吸收和合成代谢能力，生长速度是根系活力的整体表现[23]。本研究结果显示，喷施草甘膦后甘薯的根系活力均显著降低，但喷施草甘膦11 d后根系活力有所恢复。

3.2 草甘膦对甘薯EPSPS和AKR基因表达的影响

EPSPS是莽草酸途径中的关键酶[6]。草甘膦会专一抑制EPSPS活性，导致莽草酸大量积累，从而扰乱生物体正常的氮代谢而致其死亡。在草甘膦敏感型杂草中，草甘膦对EPSPS的抑制通常导致莽草酸大量积累，而在耐草甘膦或抗草甘膦杂草中莽草酸积累相对较少[24]。研究认为，可以使用莽草酸积累作为区分草甘膦抗性的参数[25-27]。EPSPS基因扩增使EPSPS过量表达产生抗药性[28]，这一机制已在8种杂草中有报告[29]。本研究中，草甘膦敏感品种N3589的莽草酸含量远高于草甘膦抗性品种鄂薯11，同时喷施草甘膦后，草甘膦抗性品种鄂薯11的EPSPS基因上调表达，这与前人的研究结果[28]一致。在喷施草甘膦后，草甘膦敏感型甘薯品种N3589的EPSPS基因显著下调，而草甘膦抗性甘薯品种鄂薯11的EPSPS基因显著上调。

AKR在植物中主要参与醛基解毒、胁迫防御、渗透液生成及二次代谢和膜运输[7,9]。在大肠杆菌中抗草甘膦品系的AKR基因表达量高于感病品系，表达的EcAKR4-1能代谢草甘膦产生氨甲基膦酸(AMPA)和乙醛酸[14]。水稻愈伤组织和幼苗对草甘膦的抗性表现为EcAKR4-1过表达和AKR活性增强。研究表明，拟南芥中AKR4C8和AKR4C9可以减少包含活性醛基的有毒化合物范围[7]。玉米的AKR4C7可以催化山梨糖醇氧化为葡萄糖[30]。来自蓝细菌鱼腥藻的AKR17A1可以催化除草剂丁草胺代谢为二羧酸和苯酚[31]。本研究结果显示，在喷施草甘膦后，草甘膦敏感型甘薯品种N3589的AKR基因先上调表达后下调表达；而草甘膦抗性甘薯品种鄂薯11的AKR基因先下调表达后上调表达。由此可推断，受到草甘膦胁迫后，草甘膦敏感材料的AKR基因迅速启动，但不能减少草甘膦的胁迫危害；而草甘膦抗性材料的AKR基因反应较迟缓，喷施草甘膦5 d后一直处于上调表达状态，其具体的代谢机理还有待进一步研究。

4 结 论

本研究结果显示，喷施草甘膦后，与敏感型甘薯品种N3589相比，草甘膦抗性品种鄂薯11的莽草酸积累较少，这是由于喷施草甘膦后抗性品种鄂薯11的EPSPS基因迅速上调表达，从而减少体内莽草酸累积对植株造成的伤害；与此同时，在喷施草甘膦后第5天开始，AKR基因迅速上调表达，从而参与了甘薯体内草甘膦的代谢，减少后期草甘膦对植株的危害。至于AKR基因如何参与草甘膦代谢，还有待于进一步研究。