乙型肝炎病毒pgRNA与不同血清学指标之间的相关性分析

张明跃 曹明 王凯翔 陈浩

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。在2017年，Lok[1]发表在《Journal of Hepatology》中的一篇review中指出，在接受核苷(酸)类药物(NA)治疗的患者中，当 HBV DNA 检测不到时，可以检测血清中的 HBV-pgRNA 用来推断 cccDNA 是否进行转录，推测血清HBV-pgRNA可作为 cccDNA 转录活性的有效替代标志物。本文通过使用北京热景生物技术股份有限公司生产的HBV-pgRNA测定试剂盒对来源于保定传染病医院的临床血清样本中的RNA进行测试，从而分析该指标与其他血清学指标之间的相关性。

资料与方法

一、一般材料

(一)样本来源 样本来源于保定传染病医院，共计332例，已知HBV DNA背景阳性167例，阴性165例；HBV-LP背景阳性191例，阴性141例；HBsAg背景阳性289例，阴性43例；HBsAb背景阳性67例，阴性265例；HBeAg背景阳性95例，阴性237例；HBeAb背景阳性189例，阴性143例；HBcAb背景阳性325例，阴性7例。在如上慢性乙型肝炎临床样本中男性202例，女性130例；年龄2～91岁，平均年龄44.5岁。

(二)试剂以及耗材 ①HBV-pgRNA测定试剂盒：北京热景生物技术股份有限公司；②磁力架：苏州海狸生物技术有限公司。

(三)主要设备 ①ABI 7500T ImePCR：Applied Biosystems；②振荡混匀器：大龙兴创实验仪器(北京)股份公司；③微型离心机：杭州米欧仪器有限公司。

二、研究方法

(一)检测方法 HBV-pgRNA采用PCR-荧光探针法，测定试剂盒以HBV-pgRNA拷贝数 ≥300 copies/mL作为HBV-pgRNA阳性标准，且所有的操作严格按照试剂说明书的要求对标本进行检测 。

(二) 统计学分析 使用GraphPad软件对HBV-DNA、HBV-pgRNA、HBV-LP三者之间的相关性进行分析；在HBeAg阳性和阴性患者中，对HBV-DNA、HBV-pgRNA以及HBV-LP的平均水平进行分析，以及对HBV-pgRNA与HBsAg和HBcAb的相关性进行分析。

结 果

一、HBV-DNA、HBV-pgRNA、HBV-LP三者之间的相关性分析

通过GraphPad相关性统计学分析证实，在332例乙型肝炎病毒感染患者样本的测试中，血清HBV-pgRNA与HBV-DNA均具有较强的相关性，且呈正相关；而血清HBV-DNA与HBV-LP以及血清HBV-pgRNA与HBV-LP具有相对较弱的相关性。

二、HBeAg阳性和阴性患者中，HBV-DNA、HBV-pgRNA以及HBV-LP的平均水平

对332例乙型肝炎病毒感染患者样本的检测数据进行分析，按照HBeAg状态进行分析发现，当乙型肝炎病毒感染患者的HBeAg呈阳性时，其血清HBV-DNA以及HBV-pgRNA的平均含量均处于较高水平，而血清HBV-LP的含量相对较低，三者的检出率接近；当乙型肝炎病毒感染患者的HBeAg呈阴性时，HBV-pgRNA的平均含量与HBV-DNA的平均含量接近，但其检出率远高于HBV-DNA的检出率。

图1 HBV-DNA与HBV-pgRNA的相关性

图2 HBV-DNA与HBV-LP的相关性

图3 HBV-pgRNA与HBV-LP的相关性

三、HBV-pgRNA与HBsAg的相关性分析

对101例乙型肝炎病毒感染患者样本的检测数据进行分析，按照HBeAg状态进行分析发现，血清HBV-pgRNA在HBeAg阳性的HBV感染者中与HBsAg具有相关性，但在HBeAg阴性HBV感染者中与HBsAg的相关性较弱。

四、HBV-pgRNA与HBcAb的相关性分析

通过GraphPad相关性分析证实，血清HBcAb与HBV-pgRNA在157例乙型肝炎病毒感染患者的测试中相关性较弱。

图4 HBV-pgRNA与HBcAb的相关性

讨 论

对于血清中检测出HBV-pgRNA的情况，Kock 1996年发表在《Hepatology》上的文献中就指出，在慢性HBV感染的血液中检测到了RNA[2]。2016年，Jansen[3]认为在接受抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者血清中发现HBV-pgRNA水平与患者病毒学应答和预后有关。2018年11月，美国食品药品管理局(FDA)上公布的《Chronic Hepatitis B Virus Infection Developing Drugs for Treatment》中指出，HBV-pgRNA可以作为早期临床试验中研究一些探索性的疗效终点的指标之一[4]。乙型肝炎临床诊断及检测新型试剂课题组在研究中证实，血清中的HBV-pgRNA为前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)，其来源为核衣壳包裹的pgRNA 在未启动逆转录步骤的情况下，直接获得包膜并从感染的肝细胞中释放出来。因该病毒颗粒所含的核酸为pgRNA，故称之为“HBV-pgRNA 病毒样颗粒”[5]。与HBsAg不同的是，由于HBV基因组全长为3.2 kb，3.5 kb长的HBV pgRNA只能由cccDNA转录产生，而不可能来自整合的HBV基因片段，所以理论上血清中HBV-pgRNA病毒样颗粒的检测更能反映肝细胞内cccDNA的状态[6](包括cccDNA存在与否及其转录活性)。同时，血清 HBV-pgRNA 仅来源于 cccDNA 且不直接被核苷(酸)类药物影响，被认为是一个理想的反映肝组织 cccDNA 的活性血清替代指标，这在鲁凤民[7]教授团队的最新研究成果中得到了证实。另外，鲁教授在研究成果中也认为检测血清中 pgRNA 病毒颗粒可以反映出患者肝细胞内 cccDNA的转录活性，并且在用NA治疗的病例中，血清 HBV-pgRNA 持续低于检测下限可用作预测标记物，以指导NA治疗的安全停药[8]。

在本研究的332例样本中，HBV-DNA与HBV-pgRNA具有较强的相关性，且呈正相关，血清HBcAb与HBV-pgRNA、HBV-DNA与HBV-LP以及HBV-pgRNA与HBV-LP具有相对较弱的相关性，在HBeAg阳性的乙肝患者中，HBV-DNA与HBV-pgRNA在患者体内均处于较高的水平，而在HBeAg阴性的乙肝患者中，HBV-pgRNA的含量要高于HBV-DNA的含量。

因此，定量检测血清HBV-pgRNA的水平可作为其他血清学检测项目的辅助检测手段，指导治疗乙型肝炎病毒感染的安全停药点。