分子标记辅助构建甜瓜CmGLK近等基因系

王晓娟 郭姚淼 张凯歌 杨路明 杨森 朱华玉

摘    要：黄绿叶色突变体是研究叶绿体发育和光合能力的重要材料，前期精细定位到一个控制叶色的CmGLK基因。为了更好地研究其功能，以黑皮甜瓜自交系HB42为轮回亲本，黄绿叶色突变体M68为供体亲本;利用与黄绿叶色共分离的cmglk-dCAPS1标记为前景选择标记，及163对在亲本间多态性好、染色体上分布相对均匀的SSR标记为背景选择标记，构建了HB42遗传背景下的cmglk近等基因系，并对其表型进行分析。结果显示，在回交两代后的入选群体平均背景回复率超过非选择条件下的理论值，BC1F1和BC2F1世代最高背景回复率单株分别为81.63%、93.98%。背景回复率最高的3个BC2F2代cmglk纯系植株的表型显示其叶色表型均为黄绿色，成熟期果实大小和含糖量与野生型相比也显著下降。

关键词：甜瓜;黄绿叶色;分子标记;近等基因系

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）06-011-09

Molecular marker-assisted construction of CmGLK near-isogenic lines in melon

WANG Xiaojuan， GUO Yaomiao， ZHANG Kaige， YANG Luming， YANG Sen， ZHU Huayu

（College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： The yellow-green leaf mutants are important materials for the study of chloroplast development and photosynthetic capacity. We have fine mapped a CmGLK gene controlling the leaf color in melon. To better investigate the biological function of the CmGLK gene in melon， we constructed a near-isogenic line of the cmglk gene by molecular marker-assisted selection. In our current study， a black rind melon inbred line HB42 was used as the recurrent parent， and the yellow-green leaf mutant M68 as the donor parent which resulted from the mutation of CmGLK gene. In the marker assisted selection， the cmglk locus co-segregating marker dCAPS1 was used as foreground selection marker， and 163 SSR markers with good polymorphism and relatively distributed on 12 chromosomes of melon were selected as background selection markers to develop the near-isogenic line of cmglk gene in the HB42 background. The results showed that the average background recovery rate of the selected population was significantly higher than the theoretical value under non-selective conditions after two generations of backcrossing. Furthermore， we investigated the phenotypes of three homozygous cmglk plants with the highest recovery rate in BC2F2 generation， which showed that all of them had yellow-green leaf color phenotype and their fruit sizes and sugar content at maturity were also significantly reduced compared to the wild type HB42.

Key words： Melon; Yellow-green leaf; Molecular markers; Near-isogenic lines

甜瓜（Cucumis melo L.）為葫芦科（Cucurbitaceae）甜瓜属（Cucumis）一年生蔓生植物，含有丰富的碳水化合物以及柠檬酸等人体所需的营养物质，深受人们的喜爱[1]。目前甜瓜已在世界范围内广泛栽培，并且成为中国、伊朗、土耳其等世界甜瓜生产大国出口创汇的重要农作物之一[2]。我国是最早栽培甜瓜的国家之一，同时也是世界上甜瓜栽培面积最大、产量最高的国家[3]。作为栽培甜瓜重要的起源地之一，我国甜瓜种质资源十分丰富[4]。

近等基因系（Near-isogenic line， NIL）是指除了决定目标性状的基因不同，其他遗传背景完全相同的一组遗传材料（品系）[5]。最早由Young等[6]和Muclmore等[7]提出，它在作物的品种改良[5-8]、基因定位[9-10]、基因的功能分析和遗传互作[11-12]等方面具有重要作用。通过构建近等基因系，还可以观察同一基因在不同遗传背景下的表现，从而可以判断其在育种上的利用价值[13]。

河南农业大学瓜类分子育种课题组保存的一个甜瓜黄绿叶色材料M68，与正常甜瓜材料相比，其植株在整个生长周期中均表现为黄绿色表型，叶片中叶绿素含量显著降低，而且光合速率也明显下降，遗传分析及基因定位表明，该性状由位于第11条染色体上一对隐性单基因（yellow green leaf，ygl）控制，该基因编码一个GLK转录因子。在M68中该基因发生了一个碱基缺失导致移码突变，从而导致其功能丧失。进一步利用该位点开发了一个dCAPS1标记，对甜瓜自然群体材料进行基因型分析，表明该标记与黄绿叶色表型共分离[1， 14]。

为了进一步研究甜瓜黄绿叶色基因的功能及其作用机制，笔者利用分子标记辅助选择技术，通过杂交、回交及自交等手段，结合前景选择和背景选择快速高效构建了cmglk基因在黑皮甜瓜自交系HB42遗传背景下的近等基因系，研究该基因在不同遗传背景下的表现，同时也为后续深入研究CmGLK基因的功能及其调控机制提供了很好的研究材料。

1 材料与方法

1.1 材料

选用黑皮甜瓜自交系HB42为轮回亲本，黄绿叶色材料M68为cmglk的供体亲本，两个亲本均来自河南农业大学瓜类作物育种课题组。由HB42×M68杂交获得F1代群体，将F1与轮回亲本连续回交2次，获得BC1F1（F1×HB42）、BC2F1（BC1F1×HB42）2个回交群体，由BC2F1群体入选单株自交获得BC2F2群体。

1.2 田间管理

材料于2018年至2020年种植于河南农业大学科教园区（郑州毛庄）。2018年春季在塑料大棚中对HB42、M68进行播种、育苗管理，并配制杂交世代F1。2018年秋季对HB42、M68及其F1进行播种育苗管理，并以HB42为轮回亲本与F1回交配制BC1F1。2019年春季对HB42、M68及其BC1F1进行播种育苗管理，并以HB42为轮回亲本与BC1F1回交配制BC2F1。2019年秋季HB42、M68及其BC2F1进行播种育苗管理，将BC2F1自交获得BC2F2。2020年夏季对HB42、M68及其BC2F2进行播种育苗管理，并自交获得纯系。每株材料均以单瓜收种。在对野生型HB42、突变体M68及其近等基因系进行表型观察试验中，采用完全随机试验设计，单株小区，5次重复，正常田间管理。

1.3 引物设计

笔者在本研究中根据前期黄绿叶色基因CmGLK的精细定位结果，使用与其共分离的cmglk-dCAPS1[14]作为前景选择标记。背景选择标记为从Zhu等[15]公布的甜瓜全基因组SSR标记中筛选出来的、均匀分布于甜瓜12条染色体上的163对引物，如附表1所示，并使用MapChart 2.2软件绘制SSR标记在染色体上的分布图。

1.4 甜瓜基因组DNA提取

在甜瓜幼苗2叶1心期采集幼嫩叶片，采用CTAB改良法[1]提取并检测样品DNA，用无菌1×TE稀释至所需浓度，-20 ℃保存备用。

1.5 PCR扩增、电泳与银染检测

参照孙小粉[16]的PCR扩增体系、反应程序，以及聚丙烯酰胺凝胶制备与银染显色的详细操作流程进行背景选择SSR标记筛选分析。前景选择分析使用cmglk-dCAPS1标记以10 μL体系进行PCR扩增，体系和程序与SSR标记相同，cmglk-dCAPS1酶切体系参考程思源[13]的方法，使用Bcc I酶进行37 ℃恒温酶切80 min，然后65 ℃ 20 min终止反应。

1.6 近等基因系构建方法

如图1所示，由HB42×M68杂交获得F1代，将F1与HB42回交获得BC1F1，利用cmglk-dCAPS1标记对BC1F1单株进行前景选择，首先选出携带GLK/glk杂合位点的单株，再利用背景选择标记对这些单株进行背景选择，选出背景回复率最高的单株，进一步与HB42回交获得BC2F1，用同样的方法选出BC2F1群体中含有GLK/glk杂合位点且背景回复率最高的单株，将该单株自交获得BC2F2群体，对BC2F2群体中具有黄绿叶色的单株进行背景选择，获得背景回复率最高的单株即完成了近等基因系的构建。

根据Hospital等[17]的轮回亲本背景回复率（Proportion of Recurrent Parent Genome，PRPG）计算公式进行计算：

[PRPG（g）=L+X（g）2L]×100%;             （1）

[G（g）=1-12g+1]。                                     （2）

公式（1）為BCg世代的轮回亲本背景回复率，X（g）代表BCg世代中背景选择标记带型与轮回亲本一致的标记数量，L代表全部背景选择标记;公式（2）为BCg世代的理论背景回复率。假定各标记位点间相互独立，g为回交次数。

1.7 表型性状调查

在甜瓜幼苗3叶1心时期，对野生型HB42、突变体M68及其近等基因系进行表型观察;授粉后35 d，测量各株系的果实质量、长度、宽度和果瓤可溶性固形物含量。每个株系随机选取3个单株分别进行3次测量。果实质量使用电子天平（TD31001）称量，单位以g计。果实尺寸使用直尺进行测量，单位以cm计。果实可溶性固形物含量使用PAL-1手持折光仪（ATAGO，日本）进行测量，单位以%计。

1.8 数据整理与分析

酶切产物带型有3种，与轮回亲本HB42带型一致标为1，与供体亲本M68带型一致标为2，杂合带型标为3，缺失带型标为0。背景选择标记与此类似，数据均在Excel 2016中处理，套入上述公式计算每个单株的背景回复率。将输入至Excel的背景选择条带位点数据整理成GGT 2.0软件数据格式，打开软件导入数据绘制入选单株的图示基因型和染色体图谱。其中紫色代表遗传背景回复率的区域，黄色代表杂合区域，红色为缺失标记。果实农艺指标所有数据在Excel 2016中整理与分析。使用SPASS 17.0软件进行卡平方、显著性测验。

2 结果与分析

2.1 亲本间背景选择SSR标记的筛选

利用野生型HB42和突变体M68 两个亲本基因组DNA，对甜瓜12条染色体上均匀分布的380对SSR标记进行多态性检测，共筛选出163对在亲本间具有多态性、且差异明显的标记，多态率为42.89%，用于背景回复率检测。

163对背景选择标记见表1，平均每条染色体上的标记数为13.58个。多态性SSR标记在染色体上的分布数量相对均匀，多数染色体上在10～15个SSR标记之间。其中第9染色体上标记数较少，仅有7对标记;CmGLK基因所在的第11染色体上多态性标记最多。2个标记之间的平均间距为2.5 Mb，最小间距0.1 Mb，位于第11染色体CmSSR24671、CmSSR24677之间，最大间距为14.77 Mb，位于第7染色体CmSSR17502、CmSSR18236之间。这些背景选择标记在甜瓜染色体上的具体位置如图2所示。

2.2 BC1F1群体候选单株的筛选

利用cmglk-dCAPS1标记对100株BC1F1单株进行前景选择，筛选出46株基因型为GLK/glk杂合位点的单株，符合1∶1分离比，部分dCAPS1酶切结果如图3-A所示。用上述163对背景选择标记对46个BC1F1群体单株进行背景回复率分析，其中标记CmSSR06968在各单株中的电泳结果如图3-B所示。46个单株的背景回复率平均值为73.27%，最低的单株仅62.05%，最高的单株可达81.63%;有18个单株的回复率达到非选择条件下的理论背景回复率75%，其中有5株的背景回复率超过了80%，每个单株的遗传背景回复基因型如图4所示。选择与轮回亲本遗传背景回复率最高的单株作为候选单株（其背景回复基因型在染色体上的分布如图5所示），进行第二次回交产生BC2F1群体。

2.3 BC2F1群体候选单株的筛选

利用cmglk-dCAPS1标记对100株BC2F1群体进行前景选择分析（图6-A），选择出46个目的基因型为杂合位点的单株，遗传符合1∶1分离比。用163对SSR标记对入选的46个单株进行PCR扩增并分析其轮回亲本遗传背景回复率（图6-B）。46个BC2F1候选单株平均背景回复率为88.92%，最低单株背景回复率为84.64%，单株最高回复率为93.98%，33个单株的背景回复率均在理论值87.5%之上，其中有13株回复率在90%之上，每个单株的遗传背景回复基因型如图7所示。其中背景回复率最高的单株各染色体上的基因型分布如图8所示，大多数染色体上的背景选择标记均回复为轮回亲本的遗传背景，达到了构建近等基因系所需轮回亲本遗传背景回复率的要求。从BC2F1中选择出与轮回亲本遗传背景最高的3个单株作为候选单株，进行自交产生BC2F2群体。

2.4 cmglk近等基因系的获得

对BC2F1筛选出的3个株系进行自交后，各选取35株BC2F2进行育苗培养，植株表型发生分离，在幼苗期即可通过黄绿表型进行前景选择。3个BC2F2株系分别获得11、11、9株黄绿色表型单株，经卡方测验，符合孟德尔分离比3∶1。每个BC2F2株系各随机选取3个单株进行自交繁殖得到纯系。

2.5 cmglk近等基因系表型分析

分别对2个亲本和3个cmglk近等基因系表型性状进行观察。与野生型HB42相比，其近等基因系生长较为缓慢，由图9-A所示，在野生型HB42的3叶1心时期，其近等基因系第3片真叶还未完全展开，且同一节位的成熟叶片面积（第2真叶）较野生型小。与野生型HB42相比，突变体M68和近等基因系在真叶抽出后整个营养生长时期在田间都表现出较野生型生长缓慢的趋势，花期并未表出明显差异。在授粉后的生殖生长时期，与野生型稳定的墨绿色果皮相比，近等基因系的果皮颜色由绿色逐渐表现为深绿色。在授粉后35 d果实成熟期，由图9-B所示，野生型果皮颜色仍然深于近等基因系果皮颜色，但是内部果肉颜色并未显现出明显差异。进一步调查了各株系的果实性状，由图9-C所示，发现近等基因系果实质量、长度、果肉厚度以及瓜瓤糖度与野生型果实的各个性状指标均有显著差异。上述结果表明，在遗传背景相似的情况下，cmglk的突变能够导致叶色发生变化和果实品质下降。

3 讨论与结论

叶色突变体是研究植物叶绿素发育和光合能力的理想材料，相关基因变异可能会导致植物叶色发育和果实品质性状受到影响[18-19]。突变体与其野生型之外的正常材料直接进行農艺指标差异分析时，往往会因为两者遗传背景的差异，产生许多不确定的因素。近等基因系是永久性的群体，它与轮回野生型亲本的遗传背景差异很小，在图位克隆、精细定位及目的基因的功能分析、农艺品质分析等方面具有重要作用[20-23]。本试验构建的甜瓜cmglk近等基因系，其目标基因来源于甜瓜黄绿叶色自交系M68，它是一个自然突变材料，该突变体在整个生长周期，全部光合器官的表型均显现出黄绿颜色，是研究甜瓜叶绿体发育的理想材料，但其野生型在繁殖过程中已经丢失，无法直接进行研究，需要构建近等基因系。在本研究中选择薄皮甜瓜自交系HB42作为轮回亲本，其果皮颜色黑色，含糖量较高，与M68的遗传背景差异大，有助于我们研究不同遗传背景下CmGLK基因突变后对植株叶色及果实营养品质的影响，同时为进一步深入研究CmGLK基因的功能及调控的分子机制提供很好的研究材料。

传统的育种技术是仅依靠田间表型选择，需要大群体进行多代回交才能选育出高质量的近等基因系，耗费大量人工及时间。应用分子标记辅助选择，可大大缩减育种年限、提高构建近等基因系的进程和准确度。前人研究表明，通过分子标记辅助选择回交3次后即可达到遗传回复率较高的近等基因系[8]。笔者在本试验中同时利用前景选择和背景选择，通过2次回交，在每一世代都进行基因型回复率检测，BC1F1世代背景回复率平均值略低于非选择条件下连续回交的理论背景回复率，到BC2F1世代已经显著超过非选择条件下连续回交的理论背景回复率，并获得背景回复率超过94.0%的单株，远高于理论背景回复率87.5%。表明同时利用前景选择和背景选择，可以有效提升轮回亲本背景遗传回复率，快速筛选出携有轮回亲本高遗传背景的目标基因近等基因系。

Sasaki等[23]将携带小穗基因qTSN12.2的IR 64-NIL12材料与其野生型水稻IR 64进行表型比较，发现近等基因系的穗型更小，茎秆更长，叶片更长且更宽，而且产量等农艺性状也发生显著变化。笔者在本试验中通过对携带黄绿叶色cmglk近等基因系与其野生型材料HB42相比，发现其叶色表型发生了显著变化，且与突变体M68叶色相似;成熟期的果实大小、含糖度等指标也显著下降。近等基因系材料消除了遗传背景的影响，能够证实这些性状差异是cmglk基因导致的。cmglk近等基因系材料的构建，不仅证实了cmglk对叶色和果实品质的影响，为进一步深入研究CmGLK基因功能及分子机制提供了独特的材料，而且为分子标记辅助甜瓜育种提供了理论指导，具有重要的理论研究意义和实践应用价值。

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