不同冬瓜品种对疫病的抗性与根际土壤微生物数量的关系

陈康丽 曾莉莎 周海琪 王芳 吴永官 唐琪璐 王益奎 杜彩娴 黎炎

摘    要：為了给不同冬瓜品种的疫病抗性评价及其生物防治机制提供依据，研究了不同抗性冬瓜品种的根际微生物群落数量及功能多样性的差异。以不同冬瓜品种为材料，采用自然病圃法调查不同冬瓜品种田间疫病抗病性，并采用叶碟诱导计数法和平板稀释计数法调查不同品种的根际微生物的多样性。结果表明，冬瓜品种之间的病情指数表现为：绿宝极早熟>小家碧玉>B214>铁柱168>S9>P33=B184=莞研1号小冬瓜;不同冬瓜品种根际土壤中疫霉分离频率、细菌、真菌和放线菌数量有一定差异，不同冬瓜品种的病情指数与可培养细菌数量、放线菌数量、B/F值（细菌数量/真菌数量）及A/F值（放线菌数量/真菌数量）均呈极显著负相关，与疫霉分离频率呈极显著正相关。综上所述，不同冬瓜品种根际土壤中的细菌和放线菌总量与品种抗性呈显著正相关，而根际土壤中的疫霉菌数量和品种抗性呈显著负相关。

关键词：冬瓜;疫病;抗性;根际土壤;微生物

中图分类号：S642.3 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）06-033-06

Correlation between phytophthora disease resistance of different wax gourd varieties and the numbers of microorganisms in rhizosphere soil

CHEN Kangli1， ZENG Lisha1， ZHOU Haiqi1， WANG Fang1， WU Yongguan 2， TANG Qilu1， WANG Yikui2， DU Caixian1， LI Yan 2

（1. Dongguan Banana and Vegetable Institute， Dongguan 523061， Guangdong， China; 2. Vegetable Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， Guangxi， China）

Abstract：In order to provided a basis for the evaluation of phytophthora disease resistance of different wax gourd varieties and the biological control mechanism of phytophthora disease， the differences of the number and functional diversity of rhizosphere microbial communities in the different resistant wax gourd varieties were studied.. In this experiment， different wax gourd varieties were used as materials. The natural disease nursery method was used to investigate the resistance of different wax gourd varieties to the phytophthora disease. Leaf disk induced counting method and plate dilution counting method were used to investigate the diversity of rhizosphere microorganisms of different wax gourd varieties. The results showed that the disease indices between the varieties of wax gourd were displayed as follows： Lübao > Xiaojiabiyu> B214> Tiezhu168> S9> P33=B184= Guanyan  No. 1 small wax gourd. There were significant differences in the isolation frequency of Phytophthora， the number of bacteria and fungi as well as actinomycetes in the rhizosphere soil of different wax gourd varieties. The disease indices of different wax gourd varieties was negatively correlated with the number of culturable bacteria， and actinomycetes， as well as B / F and A / F， but positively correlated with the isolation frequency of Phytophthora. In conclusion， the total amount of bacteria and actinomycetes in the rhizosphere soil are positively correlated with the variety resistance， while the total fungi are negatively correlated with the variety resistance.

Key words： Wax gourd; Phytophthora disease; Resistance; Rhizosphere soil; Microorganism

冬瓜疫病是由鞭毛菌亚门真菌疫霉菌（Phytophthora de Bary）侵染所致的一种土传性病害，苗期和成株期均可侵害，主要危害瓜果、茎、叶等器官[1-3]。近年来，随着冬瓜种植面积的扩大和复种指数的增大，加上冬瓜种植品种的单一化和种植地区的集中化，冬瓜疫病的发生日趋严重和频繁，造成冬瓜大量减产，甚至绝收。生产上防治冬瓜疫病常见的方式是化学防治，对于防治冬瓜疫病药剂的筛选和研究卓有成效，有安克可湿性粉剂、施得益可湿性粉剂、瑞毒镁锰锌可湿性粉剂等[4-5]。但化学防治方式有一定弊端，化学药剂虽能杀死病菌，但同时也会大量杀死土壤中有益微生物，损害土壤的自我修复能力。此外，化学防治存在农药残留、环境污染、有害生物产生抗药性等缺点。因此，选育抗病品种与相对安全无污染的生物生态防控技术成为近年来的研究重点。目前，生物防治研究工作主要集中在拮抗菌筛选与利用及作物自身抗病机制的研究方面[6]。左存武等[7]研究表明，高抗枯萎病香蕉海贡和抗枯5号等品种的根系分泌物具有杀真菌作用，对土壤微生物多样性的研究为基础的生物防治提供了一条思路。但这些拮抗菌及其衍生物常出现实验室或盆栽栽培防治效果好，而大田生产防效则较差的现象，主要原因是田间土壤中微生物的复杂性、室外天氣等不可控因素多，以及不同抗性品种的根系分泌物存在差异等[8]。

目前对不同品种根际微生物的差异性研究已取得了一定的进展。漆艳香等[9]对22份抗、感枯萎病香蕉种质抽蕾期根际微生物数量研究表明，抽蕾期不同香蕉种质根际微生物数量存在显著差异，抗病香蕉种质根际细菌、放线菌数量显著高于感病种质，而根际真菌和Foc（尖孢镰孢菌古巴专化型）数量显著少于感病种质。王戈等[10]对不同烤烟品种不同生育时期以及接种黑胫病菌后根际可培养微生物数量差异进行了研究，结果表明，团棵期和旺长期细菌和放线菌数量与品种抗性呈正相关，真菌数量与品种抗性呈负相关。在人工接种黑胫病菌条件下，抗病品种根际环境刺激了细菌生长，而相对抑制感病品种细菌生长，不同品种均促进了根际真菌和放线菌生长，且真菌数量与品种抗性呈负相关。目前对不同抗、感疫病冬瓜品种与根际土壤微生物关系的研究尚未见报道。笔者通过研究不同冬瓜品种对疫病的抗病性及其与土壤微生物数量的关系，分析不同抗、感冬瓜品种的根系土壤中病原菌数量及微生物群落结构间的差异，以期为不同抗病性冬瓜品种的合理布局和冬瓜疫病的生物生态防治提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地设置在广东省东莞市香蕉蔬菜研究所基地的大田。试验地前茬种植冬瓜，为冬瓜疫病重病田，试验地的土壤类型为壤砂土，供试土壤基本性状为：pH 值 6.09，有机质含量（w，后同）为 1.2%，水解氮 122.7 mg·kg-1，铵态氮0 mg·kg-1， 硝态氮122.70 mg·kg-1，磷 70.90 mg·kg-1，钾95.60 mg·kg-1。

1.2 材料

试验品种从广东、湖南及广西等地收集引进，包括莞研1号、绿宝极早熟和铁柱168等8个广东省栽培面积较大的主推冬瓜品种。

1.3 方法

1.3.1 田间抗病性调查 为使试验结果更加切合生产实际，采用田间自然感染发病。2017年4月份，对试验冬瓜进行育苗，9月即冬瓜疫病发病高峰期对冬瓜疫病的发病情况进行调查，每个品种调查10株，3次重复。参照郑果[11]的方法记录冬瓜疫病的发病率，并对冬瓜的发病程度情况进行分级，计算不同品种的发病率及病情指数。

病情指数=Σ（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高严重度代表值）×100。

抗性分级标准：高抗（HR）：病情指数≤10;抗病（R）：10<病情指数≤40;感病（S）：40<病情指数。

1.3.2 土壤中疫霉菌及微生物多样性调查 种植冬瓜苗前，在试验地里采用“S”形采样法随机取五点土样，去掉0～5 cm的表土，取深约20 cm的土壤，剔除石砾、植物残根等杂物，混合均匀，依四分法保留30～50 g土样，无菌袋收集，置于0～4 ℃冷藏保存。

在调查不同冬瓜品种的发病情况时，随机抽取5 株瓜苗，采集其根际土。小心铲去冬瓜根表面5 cm的表土，收集附着在根系上的土壤作为根际土壤，并将相同冬瓜品种的土样混合均匀，依四分法保留30～50 g土样，用无菌袋收集，于0～4 ℃冷藏。

采用稀释涂布平板法分离并计算土壤中的微生物数量。细菌用牛肉膏蛋白胨琼脂，放线菌用高氏1号琼脂，真菌用马丁氏琼脂[12]。疫霉用选择性V8汁培养基[13]，疫霉计数采用叶碟诱导计数法[14]（图1）。将采集晾干的土样研碎并过筛，取10 g研细的土样装入经灭菌的培养皿中，加灭菌水至饱和，在28 ℃培养箱中静置24 h，用打孔器将冬瓜叶片切成直径1 cm的圆形小块若干块，使其漂浮在土样上面的无菌水中。每个处理设3个重复，置于28 ℃培养箱中，48 h后观察叶片发病情况。受侵染的叶片边缘出现水渍状斑。将发病的叶片经70%酒精或0.1%升汞消毒，用无菌水洗净后移入选择性V8汁培培养基上，在28 ℃黑暗培养。待长出菌落，从边缘挑取少量的菌丝镜检叶饵上的孢子囊，判断是否是疫霉菌孢子囊，进而计算疫霉分离频率。

疫霉分离频率/%=Σ着生孢子囊叶饵数/检查叶饵总数×100。

1.4 数据处理与分析

试验数据采用SPSS 19.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同冬瓜品种的田间抗病性与根际土壤疫霉菌

由表1可知，8份冬瓜品种的田间自然发病率、病情指数以及疫霉分离频率等指标存在一定差异。冬瓜田间自然发病率及病情指数从高到低分别是：绿宝极早熟>小家碧玉>B214>铁柱168>S9>P33=B184=莞研1号小冬瓜，其中P33、莞研1号小冬瓜、B184在冬瓜病地种植90 d后均没有发病，表明P33、莞研1号小冬瓜、B184这3份冬瓜品种田间表现为高抗;B214、铁柱168及S9的田间自然发病率为10%～20%，病情指数为10～40，表明B214、铁柱168及S9这3份冬瓜品种田间表现为抗病;绿宝极早熟和小家碧玉田间自然发病率达30%以上，病情指数达到40以上，表明绿宝极早熟和小家碧玉这2份冬瓜品种田间表现为感病。

不同冬瓜品种根际土壤中的疫霉菌采用叶碟诱导法进行诱导分离后，在选择性V8汁培养基中受侵染的叶片边缘出现水渍状斑，随后长出稀疏的菌丝并形成白色菌落（图2）。根际土壤中疫霉菌数量多的是绿宝极早熟、小家碧玉及B214冬瓜，疫霉分离频率高达100%，表明以上3份冬瓜品种对疫霉的富集能力强，比较容易被疫霉病菌侵染，进而可能导致这些品种的田间自然发病率高。S9、铁柱168和P33等 3份冬瓜品种的根际土壤中疫霉菌的数量较多，疫霉分离频率在50%以上;其根际土壤中疫霉菌数量较少的品种是莞研1号小冬瓜和B184，疫霉分离频率在50%以下，可推测这两份冬瓜品种感染疫病的概率相对较小。

2.2 不同冬瓜品种根际土壤微生物多样性

由图3可以看出，冬瓜根际土壤微生物均以细菌最多，其次是放线菌，真菌最少。其中，B214、P33、B184和莞研1号小冬瓜4个品种冬瓜土壤中细菌数量均比种植前多，其他4个品种根际土壤中细菌数均低于种植前;根际细菌数量较多的是P33、B184，根际细菌数量最少的是小家碧玉，P33、B184根际细菌数显著高于小家碧玉，但与其他5个品种差异不显著。真菌数量最多的是B214，真菌数量较少的是S9、B184和莞研1号小冬瓜;与种植前相比，种植冬瓜后土壤中真菌数量均有所降低，抗病品种S9、B184和莞研1号小冬瓜根系的真菌显著低于种植前的土壤真菌数量。种植冬瓜后土壤中放线菌数量最多的是B184，其次是P33和莞研1号小冬瓜;与种植前相比，土壤中放线菌数量显著减少的冬瓜品种有小家碧玉、绿宝极早熟和铁柱168。

抗病品种莞研1号小冬瓜和B184的B/F值 （细菌数量/真菌数量）和A/F值（放线菌数量/真菌数量）均较大，小家碧玉和B214的B/F值均较低，绿宝极早熟和小家碧玉的A/F值均较低。其中，莞研1号小冬瓜和B184的B/F值均显著高于小家碧玉和B214，且均与其他4个品种差异不显著;莞研1号和B184的A/F值均显著高于绿宝极早熟、小家碧玉、B214和铁柱168;且均与其他2个品种差异不显著。表明种植这2个冬瓜品种后的土壤微生物区系为高肥的“细菌主导型”土壤，相对于其他栽培品种更健康。

由表2可以看出，不同抗、感疫病冬瓜品种的病情指数与可培养细菌数量、放线菌数量、B/F值及A/F值均呈极显著负相关，与疫霉分离频率呈极显著正相关，表明冬瓜根际细菌数量、放线菌数量、B/F值及A/F值与品种抗性呈极显著正相关，而病原疫霉菌数量则与品种抗性呈极显著负相关。

3 讨论与结论

植物在生长过程中，根系会通过各种方式向周围环境释放多种无机、有机物质——根系分泌物。根分泌物为根际土壤中的微生物提供了能源物质，其成分和数量会影响根际微生物的种群结构和数量[15-16]。影响根系分泌物的因素有很多，其中植物品种和作物基因型不同，其产生的根系分泌物的组成及数量也不同[17-20]。作物根际微生物的数量和群落结构变化与作物土传病害的发生关系密切，一定程度上也是作物根际土壤微生物群体互作的结果[21]。

相关研究表明，土壤中细菌数量的增加有利于土壤养分的转化，能为植物的生长提供良好的环境，并且为有机、无机物的转化提供理想的条件;而土壤中放线菌数量的增加不仅能促进土壤有机质转化，还能产生抗生素，对其他有害微生物起到一定的拮抗作用[22-26]。笔者的研究结果表明，种植P33、B184和莞研1號小冬瓜等抗病品种后，土壤中的细菌数量及放线菌数量增加，而真菌数量降低。这可能与抗病冬瓜品种所分泌的根系分泌物能抑制病原真菌的繁殖与生长，促进细菌和放线菌繁殖与生长有关。此外，种植抗病冬瓜品种后，细菌和放线菌数量的增加成为冬瓜根际土壤的优势菌群，一定程度上能有效地降低了根际真菌数量，且与病原微生物竞争养分，间接抑制有害微生物的生长，使根际微生物区系向健康的方向发展。

综合分析表明，冬瓜根际细菌数量、放线菌数量、B/F值及A/F值与品种抗性呈极显著正相关，而病原疫霉菌数量则与品种抗性呈极显著负相关，此结果与漆艳香等[9]、王戈等[10]的研究结论相似。此外，韩李菲[27]研究表明，海贡、抗枯5号等抗枯萎病的香蕉品种，其根系分泌物中有抗真菌成分，有的品种有杀菌作用，可应用于植物源杀菌剂，有的品种能够抑制菌丝的生长和孢子萌发，但无杀菌作用。巴西蕉等感病香蕉的根系分泌物能为病原物的生长提供营养。上述研究表明抗病冬瓜品种的根系分泌物可能促进细菌与放线菌的繁殖与生长，抑制真菌病原菌的繁殖与生长;而感病冬瓜品种的根系分泌物可能抑制细菌与放线菌的繁殖与生长，促进真菌病原菌的繁殖与生长。

笔者在本试验中初步探索了冬瓜疫病田间自然发病与根际微生物之间的联系与差异，可为研究冬瓜疫病生物生态防治机制提供依据。但只是基于传统平板稀释计数法对部分冬瓜品种的根际微生物进行初步研究，接下来还需扩大品种样本量进一步研究抗、感病冬瓜种质根际微生物差异并弄清其差异形成的机制，探究抗、感疫病冬瓜种质内生微生物的差异及多样性;并对抗、感疫病冬瓜种质所分泌的根系分泌物组成和数量的差异及其对土壤微生物的影响作进一步的研究。

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