辽宁设施辣椒连作根系土壤特性及微生物区系结构特征

王 辉, 刘 丽, 黄宇飞, 邹春蕾, 赵 颖, 刘长远

（1.辽宁省农业科学院a.植物保护研究所，b.蔬菜研究所，c.植物营养与环境资源研究所，沈阳110161；2.沈阳农业大学植物保护学院，沈阳110866）

辽宁是我国北方重要的蔬菜生产基地，在北菜南运中起着重要作用[1]。辽宁设施蔬菜生产起源早，长期单一作物连续种植导致了病害发生严重、土壤养分失衡、土壤微生物种群结构失衡等现象普遍存在[2-3]。辣椒（Capsicum annuumL.）作为主要蔬菜品种在辽西南地区广泛种植，近些年栽培面积不断扩大，轮作倒茬困难及设施特有的温湿度环境，导致了多种土传病害频发、土壤盐渍化加重、土壤酶活性下降等连作问题[4-6]，严重限制了辽宁设施辣椒栽培安全和可持续发展。土壤微生物群落结构与多样性直接影响了土壤酶活性、土壤养分利用率与植物的生长发育[7]。如，丛枝菌根真菌（AMF）可以与多种植物建立共生关系[8]，通过增强植物抗逆性、促进土壤磷素吸收[9-10]，从而有效缓解由连作障碍引起的病虫害，提高宿主植物的抗病性[11]。植物根际促生菌（PGPR）做为一类有益微生物（群），可以通过改变土壤原有微生物组成结构，恢复土壤微生态环境[12-13]，达到防治病害、促进植物生长发育、增加作物产量的作用[14]。

目前，设施辣椒生产研究热点集中在抗病种质资源的筛选与抗病基因的挖掘上[15]，针对辽宁设施辣椒根际土壤特性与微生物区系结构特征的研究尚未见报道。本研究以鞍山（辽南）与锦州（辽西）连续种植辣椒10 年的土壤为研究对象，利用Illumina Hiseq 高通量测序平台分析辣椒根际土壤细菌与真菌菌群结构特点，测定土壤营养与土壤酶活，并进行相关性分析，研究结果可以揭示辽宁设施辣椒连作土壤微生态特点，为维持辽宁设施辣椒健康土壤生态环境、保证辣椒的可持续生产及土壤改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

鞍山市温香镇东高村与锦州市吴家镇吴家村是辽宁省辣椒主产地，单一种植辣椒均在10年以上。东高村位于辽宁南部，北纬41°04′93"，东经122°60′07"，年平均气温10.4℃，年降水量721.3mm，日照时数为1551.25h；吴家村位于辽宁西部，北纬41°46′13"，东经122°00′39"，年平均气温8.2℃，年降水量604.8mm，日照时数为2871h。两地辣椒8月中旬定植，10月上市，翌年7月中旬拔秧。吴家村与东高村种植辣椒品种均为牛角椒。

1.2 方法

2018 年7 月分别于鞍山市东高村与锦州市吴家村选择3 栋温室，每栋温室内对角线四点与中心点位置各选取5株健康辣椒植株连根拔起[16]，抖落根系表面结合疏松土壤，附着于辣椒根上的土壤即为根际土壤。将同一地区3 个温室采集到的土壤充分混匀，过筛（d=2mm）后装入无菌袋中编号并放置于冰盒内带回实验室：5.0g液氮速冻后于-80℃保存用于土壤微生物多样性测定；150.0g（湿润土壤）储存于-20℃用于测定土壤酶活，并在7d内完成；风干后土样200.0g用于测定土壤营养。

1.2.1 土壤理化性质测定 土壤pH值测定采用水浸pH计法[17]，含水量（MC）测定采用称重法[18]，有机质（SOM）测定采用重铬酸钾容量法[19]，全氮（TN）测定采用全自动凯氏定氮仪法[20]，有效磷（AP）测定采用碳酸氢钠浸提-紫外光度法[21]，有效钾（AK）测定采用乙酸铵浸提-原子吸收分光光度法[22]，有效铁锰铜锌（AFe、AMn、ACu、AZn）测定采用DTPA浸提-原子吸收分光光度法[23]。

1.2.2 土壤酶活性测定 土壤荧光素二乙酸酯水解酶（FDA）测定以荧光素二乙酸酯为底物，参照GILLIAN 等的方法[24]；蛋白酶（Pro）测定以酪蛋白钠为底物，参照LADD等的方法[25]；酸性磷酸单酯酶（APA）、β-葡萄糖苷酶（BG）与脱氢酶（TTC）测定分别以对硝基苯磷酸钠、β-D-葡萄糖苷与2，3，5-氯代三苯基四氮唑为底物，参照WEAVER 等的方法[26]；过氧化物酶（POD）测定以过氧化氢为底物，参照TRASAR 等的方法[27]；N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶（NAG）测定以对硝基苯基-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物，参照PARHAM 等的方法[28]；酚氧化酶（PHO）测定以酚醛酸L-3,4-二羟基苯丙氨酸为底物，参照PIND等的方法[29]。

1.2.3 土壤微生物多样性分析 利用土壤微生物DNA 提取试剂盒（美国, MOBIO）提取土壤样品基因组DNA，对细菌16S rDNA（V3+V4）、真菌ITS1 rDNA 进行PCR 扩增，产物经1.8% 凝胶电泳，OD260/280、OD260/230检测纯度。土壤微生物多样性分析基于Illumina HiSeq 测序平台双末端测序方法：对相似度97% 以上的Tags进行聚类，获得分类单元OTU；利用Unite 数据库对OTU 进行分类学注释，Megan 5.0 分析优势物种分布，Mothur Version v.1.30进行Alpha多样性分析，利用Qiime进行Bate多样性分析。

细 菌16S rDNA（V3 + V4）引 物338F 为5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；806R 为5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；程序为98℃2min；98℃30s，50℃30s，72℃1min（25循环）；72℃5min，4℃保持。

真菌ITS1 引物为ITS1 5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS2 为5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。程序：95℃5min；95℃30s，50℃30s，72℃40s（35循环）；72℃7min，4℃保持。

1.2.4 与环境因子的相关性分析 选择差异显著的土壤环境因子，使用R Vegan 开展属分类学水平下样品与物种间的相关性分析。

1.3 数据分析方法

试验所得数据结果采用SPSS 22.4 软件T 检验（Independent-Sample t Test）进行差异显著性分析，p＜0.05 为差异显著，p＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 辽宁设施辣椒连作根系土壤养分状况

土壤营养与理化性质测定结果表明（表1），鞍山与锦州辣椒连作10a 土壤均呈现弱酸性（pH＜7.0）；有效磷、有效铜与有效锌含量锦州高于鞍山，含水量、全氮、有机质、有效钾、有效铁与有效锰含量锦州低于鞍山。T值检验结果表明，两地的有效钾、有效铜与有效锌含量差异极显著（p＜0.01）、含水量为显著差异（p＜0.05），而鞍山与锦州地区pH 与全氮、有机质、有效磷、有效铁及有效锰含量无显著差异。

表1 不同采样点土壤理化性质Table 1 Soil physical and chemical properties of different sampling locations

2.2 辽宁设施辣椒连作根系土壤的酶活性

鞍山与锦州土壤酶活性测定结果表明（表2），鞍山辣椒连作土壤蛋白酶与N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶活性略低于锦州，而FDA 水解酶、酸性磷酸单酯酶、酚氧化酶、过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶与脱氢酶活性均高于锦州。T 检验结果表明，两地区只有酸性磷酸单酯酶与β-葡萄糖苷酶活性为极显著差异，其余6种酶活性无显著差异。

表2 不同采样点土壤酶活性Table 2 Soil enzyme activities of different sampling points

2.3 辽宁设施辣椒连作根际微生物多样性分析

2.3.1 序列统计 不同分类水平物种数量差异分析表明（表3），锦州地区土壤细菌数量在门、纲、目、科、属的数量略高于鞍山；锦州地区真菌数量在门、纲水平略高于或等于鞍山，目、科、属水平数量则低于鞍山。两地区4项序列指标经T检验后，均无显著差异。

表3 不同分类水平微生物数量Table 3 Number of microorganisms at different taxonomic levels

2.3.2 优势物种与结构组成 优势细菌门相对丰度水平表明（表4），锦州与鞍山地区优势细菌结构相似。两地区除变形菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门与疣微菌门丰度水平存在显著或极显著差异外，其余6 个物种丰度水平无显著差异；变形菌门是两个地区共有的绝对优势物种。属水平上，两个地区的优势物种相同，但丰度水平有所差异，导致了组成结构有所差异：鞍山土壤中丰度最高的为鞘脂单胞菌属，其次为爪耳木属、芽单胞菌科（未能鉴定到属，下同）；锦州土壤中丰度最高的为芽单胞菌科，其次为厌氧绳菌科与爪耳木属。两地区的优势属经T检验后，相对丰度均无显著差异。

表4 优势细菌丰度Table 4 Abundance of dominant bacteria

优势真菌门丰度水平结果可知（表5），丰度为0.04%的隐真菌门与丰度为0.09%的虫霉门分别是鞍山与锦州特有优势物种；除此之外两地区共有优势真菌8类（未分类、未知与其他的除外）。子囊菌与担子菌是两地区共有的绝对优势物种，其相对丰度之和＞50%，且丰度水平无差异；其余6 个物种丰度水平较低，其中丝足虫类与壶菌门两个地区丰度存在极显著差异与显著差异；被孢霉门、Aphelidiomycota（未命名）、轮虫动物门与油壶菌门丰度无显著差异。两地区的优势真菌属相同，丰度水平虽无显著差异，但也导致了物种结构不同：鞍山土壤样本中瑞默氏属丰度最高，其次为锥盖伞属与嗜热链球菌；锦州土壤样本中嗜热链球菌丰度最高，其次为毁丝霉属与锥盖伞属。

表5 优势真菌丰度Table 5 Abundance of dominant fungi

2.3.3 多样性分析 Alpha稀释性曲线表明（图1），鞍山与锦州土壤样本获得的真菌与细菌序列均随着测序数的加大趋于平缓，说明增加测序数据无法再找到更多的OTU，数据量充分，测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种。PCA 主成分分析结果表明（图2），主成分1 对细菌群落与真菌群落的差异解释贡献值分别为63.90%、62.65%，受主成分1，2的影响，鞍山的3个样品聚于负坐标轴，锦州的3个样品聚于正坐标轴内，具有明显的区域性特征。Alpha 多样性比较结果表明（表6），鞍山细菌OTU 数量为1501 个，锦州为1412 个，文库覆盖率均达100%；ACE 与Chao1指数鞍山均大于锦州，Simpson指数相同，Shannon指数鞍山稍低于锦州。真菌OTU数量鞍山多于锦州，覆盖率均达100%；ACE、Chao1 与Shannon 指数鞍山均大于锦州，Simpson 指数鞍山低于锦州。以上结果表明，鞍山土壤细菌丰度大于锦州，但细菌多样性略低于锦州；鞍山土壤真菌丰度与多样性均高于锦州。

图1 Alpha多样性稀释性曲线Figure 1 Rarefaction curve of Alpha diversity

图2 Beta PCoA多样性分析Figure 2 Beta PCoA diversity analysis

表6 细菌与真菌Alpha多样性指数Table 6 Alpha diversity indexes of bacterial and fungal

2.4 与环境因子RDA分析

选取鞍山与锦州差异显著的营养因子（有效钾、有效铜、有效锌）与土壤酶（β-葡萄糖苷酶与酸性磷酸单酯酶），开展与土壤样品及微生物多样性之间的RDA（Redundancy analysis）分析。图3表明，同一地区细菌与真菌的3 个重复点距离较近，类群组成相近，重复性好。主成分1，2 对细菌群落差异的解释贡献值为55.49% 与16.31%，对真菌群落差异解释值为41.62% 与18.03%。图中灰色实线位置表明，有效铜及有效锌间为锐角，含量呈正相关，两者与有效钾、β-葡萄糖苷酶与酸性磷酸单酯酶成钝角，为负相关；灰色实线与样品点位置表明，有效铜及有效锌含量与锦州样品细菌、真菌多样性均为正相关，与鞍山样品细菌及真菌多样性为负相关。灰色实线与蓝虚线夹角表明，有效铜与有效锌正相关影响Chryseolinea（未命名）与Reyranella（未命名）等6个细菌丰度及曲霉属、嗜热链球菌属、嗜热毁丝霉属3个真菌丰度，有效钾、β-葡萄糖苷酶与酸性磷酸单酯酶正相关影响芽单胞菌属与鞘氨醇单胞菌属等2个细菌丰度及淡紫拟孢菌属与被孢霉属等7个真菌丰度。

图3 样品及物种与环境因子RDA分析Figure 3 RDA analysis of samples, species and environmental factors

3 讨论与结论

辽宁是设施蔬菜种植大省[1]，2017 和2018 年连续两年设施蔬菜种植面积近13 万hm2。辣椒作为我国蔬菜第二大作物栽培面积不断扩大的同时[30]，连作障碍问题日益突出。本研究利用高通量测序技术，直接提取根际土壤总DNA，全面研究土壤微生物群落组成、遗传信息及与所处环境的相关性，克服了传统方法针对可培养微生物分离培养的局限，突破了针对靶标优势菌的指纹图谱分析，完整清晰地揭示以鞍山与锦州为代表的辽宁设施辣椒连作土壤微生物多样性与土壤特性。

辽宁地区由于连续种植与辣椒需肥特性导致了土壤氮、磷、钾比例失调，而辣椒又为无限生长类型，整体需肥量较大，因此设施产业的发展受到制约。适当地调整土壤养分含量可以提高果品品质与产量，刘广富等[31]研究表明，适当添加微量元素可以增加辣椒根系鲜重、干重与根系活力，并提高果实维生素C与辣椒素含量；此外，张敏等[32]研究结果表明，土壤微生物多样性降低严重抑制了土壤氮磷钾的转化，从而影响了油菜的生物量；KANG 等[33]发现，高寒湿地土壤有机碳、速效磷和速效钾显著影响真菌多样性和群落结构；本研究结果表明，土壤中的有效铜、有效锌含量与锦州土壤细菌及真菌多样性成正相关，而有效钾含量及β-葡萄糖苷酶、酸性磷酸单酯酶活性与鞍山土壤细菌及真菌多样性成正相关。由此可见，土壤微生物与土壤养分及植物三者间互相影响，共同协调维持着土壤微生态环境，土壤营养是可以通过改变土壤微生物多样性实现，反之土壤营养也直接影响着土壤微生物多样性与结构，因此本研究结果可以为改良辽宁设施土壤提供理论基础。

此外，鞍山与锦州地区细菌优势菌门与优势菌属相同，只在门水平菌群丰度有所差异，属水平所有物种丰度均无显著差异；优势真菌门中有8 个为共有物种，其中壶菌门与丝足虫类丰度存在显著差异与极显著差异；属水平优势真菌物种与丰度无显著差异。这一现象是由自然因素与人为因素差异引起的：锦州与鞍山均长期种植辣椒，使得土壤中的优势微生物种类相同或差异不大。但因为两个地区所处的地理位置不同，但年平均气温、年降水量及日照时数存在一定差异，特别是管理习惯不同导致了物种结构存在差异性。