健脾化瘀方改善晚期胃癌血液高凝状态的作用机制研究

凌博凡, 江羽琪, 侯 茜, 施 铮, 金志超

(1. 南京中医药大学附属医院 肿瘤内科, 江苏 南京, 210029; 2. 南京中医药大学第一临床医学院, 江苏 南京, 210023; 3. 东南大学附属中大医院 中医内科, 江苏 南京, 210009; 4. 南京中医药大学中医药文献研究所, 江苏 南京, 210023)

研究[1-2]表明，恶性肿瘤患者血液高凝状态发生率约90.0%, 血栓栓塞发生率8.0%～19.0%, 在晚期胃癌中这2项数据分别为84.4%、13.0%[3]。静脉血栓栓塞(VTE)已成为造成肿瘤患者死亡的第2位原因[4-5]。肿瘤血液高凝状态的发生机制复杂，包括肿瘤相关慢性炎症的促凝作用[6-8], 组织因子(TF)本身及其所介导的促凝途径，血管内皮生长因子(VEGF)的促内皮细胞活化作用[9-10], 以及血小板增多及活化等，各途径之间还会相互刺激、相互促进，造成恶性循环。晚期胃癌(Ⅲ～Ⅳ期)血液高凝状态患者中“脾胃虚弱、气虚血瘀证”最为多见[11-14], 因此临床上常选用健脾益气、活血化瘀法进行治疗。健脾化瘀方是本院肿瘤内科常用验方，方中太子参、白术、淮山药、黄芪、茯苓、薏苡仁益气扶正，丹参、三棱、莪术、三七活血化瘀，可顾护脾胃之气，扶助正气，提高免疫，佐以活血化瘀、清热解毒之药，较单纯活血化瘀的疗效更佳。本研究探讨健脾化瘀方治疗Ⅲ～Ⅳ期胃癌合并血液高凝状态患者的有效性与安全性，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本试验获得南京中医药大学附属医院伦理委员会批准(批件号2020NL-087-03)，并在中国临床试验注册中心注册(注册号ChiCTR2000034942), 所有患者均签署知情同意书。根据以往试验并查阅文献，预估试验组有效率为66%, 对照组有效率为25%, 根据统计学要求，取单侧α=0.025, β=0.20, 设非劣效性界值δ=0.10, 试验组与对照组按1∶1分配，估算出每组病例数应为22例。2020年1月—2020年12月在南京中医药大学附属医院(江苏省中医院)肿瘤内科采用随机数字表法，并用区组随机的方法，将受试者按照1∶1的比例随机分组，共入组符合标准患者50例(试验组25例，对照组25例)。最终试验组脱落3例，对照组脱落1例，共完成患者46例(试验组22例，对照组24例)。2组患者入组时年龄(P=0.123)、性别(P=0.747)、病程分期(P=0.333)的差异均为统计学意义。

1.2 相关标准

1.2.1 胃癌的诊断与分期标准: ① 胃癌诊断标准参照《中华人民共和国卫生行业标准》(WS16-2010)中“胃癌诊断标准”[15]。② 胃癌分期标准参照2016年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会(UICC/AJCC)TNM分期标准(第8版)[16]。

1.2.2 晚期胃癌血液高凝状态诊断标准: 参照第7届全国血栓与止血学术会议所拟“前DIC(Pre-DIC)诊断参考标准”。满足以下2项或以上者，可诊断血液高凝: ① D-二聚体(D-D)>0.5 mg/L; ② 纤维蛋白原(FIB)>4 g/L; ③ 活化部分凝血活酶时间(APTT)缩短>3 s; ④ 凝血酶时间(TT)缩短>3 s; ⑤ 血小板(PLT)>300×109/L。

1.2.4 纳入标准: ① 病理确诊为胃癌者; ② 符合晚期胃癌诊断标准者，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期; ③ 符合本研究所拟定的血液高凝状态诊断标准者; ④ 符合“血瘀证”合并“脾胃虚弱证”标准者; ⑤ 年龄18～80岁者; ⑥ 体力状况评分(KPS评分)≥60分者; ⑦ 预计生存期≥3个月者; ⑧ 入组前2周内未行止血、溶栓、抗凝、抗血小板、非甾体类抗炎药或中药活血化瘀治疗者; ⑨ 自愿接受本试验研究，并根据药品临床试验管理规范(GCP)要求签署知情同意书。

1.2.5 排除标准: ① 消化道梗阻、空肠造口等不能口服药物的患者; ② 有症状的脑转移或精神障碍患者; ③ 患有严重心血管疾病、慢性肝病、肾病、血液病的患者; ④ 有活动性出血或有出血倾向者; ⑤ 患有严重不可控制的医学疾病或急性感染的患者; ⑥ 实验室检查异常者，血常规中性粒细胞(ANC)<2.0×109/L, 血红蛋白(Hb)<90 g/L, PLT<80×109/L; 肝功能总胆红素(TBil)>1.5倍正常上限，谷氨酸-丙酮酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)>1.5倍正常上限; 肾功能内生肌酐清除率(CCr)<50 mL/min, Cr>1.5倍正常上限; ⑦ 孕妇、哺乳期患者; ⑧ 药物滥用或临床、心理和社会特征干扰研究和知情同意的患者。

1.3 治疗方法

试验组与对照组患者均接受肿瘤基础治疗(正常化疗及对症支持治疗)，试验组患者治疗同时还口服健脾化瘀方(党参30 g, 黄芪15 g, 炒白术15 g, 薏苡仁30 g, 茯苓10 g, 半枝莲15 g, 重楼9 g, 三棱10 g, 莪术10 g, 丹参10 g, 三七10 g, 蛇舌草15 g, 菝葜15 g), 1剂/次, 2次/d, 口服21 d为1个周期，服用2个周期，共计(42±2) d。临床试验期间，除接受肿瘤基础治疗外，不得加用改善高凝状态和影响炎症反应的药物。

1.4 观测指标

2组病例均观察(42±2) d, 时间点为基线(第1天)、访视2[第(21±2)天]、访视3[第(42±2)天]，采集评价试验有效性的试验数据。部分指标因患者意愿而未完成检测或记录。主要观测指标: ① 凝血指标，包括D-D、FIB、APTT、TT; ② TF。次要观测指标: ① 炎症因子，包括白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α); ② 血小板聚集试验。

1.5 组织因子及炎症因子检测

采用ELISA法检测血清中TF含量。选用人TF的ELISA试剂盒(货号JM-03291H1), 采用酶联免疫检测仪检测。方法为: ① 配制标准品; ② 在各孔中加入已稀释的样品; ③ 37 ℃反应90 min; ④ 加入TF抗体工作液至酶标板孔中, 37℃反应60 min; ⑤ 洗涤后将ABC工作液依次加至酶标板中，盖上封板膜，37 ℃反应30 min; ⑥ 洗涤后，加入TMB显色液, 37℃避光反应20 min后加入TMB终止液，酶标仪在450 nm处测定吸光度(OD)值。

采用CBA(Cytometric bead array)法检测血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量。选用试剂盒BDTMCytometric bead array(CBA)Human Inflammatory Cytokine Kit (货号551811), 采用BD FACSCelestaTM流式细胞仪检测。方法为: ① 制备标准品，将标准品小球转移到流式管中，稀释液重悬标准品，室温下平衡15 min。② 混合细胞因子的捕获微球，将IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α捕获微球加入流式管中，充分涡旋混匀，室温避光孵育30 min。③样本检测，混匀捕获微球，加入标准品或待测样本及PE检测试剂。室温避光孵育4 h, 洗涤，上流式细胞仪检测。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0软件、ELISA处理软件、Excel软件分析结果。资料中符合正态性分布的数据使用t检验，不符合正态性分布的数据使用秩和检验。数据相关性采取双变量相关分析，符合正态分布的数据选择Pearson相关分析，不服从正态分布的数据选择Spearman相关分析。所有统计结果均采取双侧检验,P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组患者凝血指标比较

2组患者基线时D-D、FIB、APTT、TT差异均无统计学意义(P>0.05); 治疗后，与对照组比较，试验组访视3的D-D、FIB较低，TT延长，差异均有统计学意义(P<0.01); 试验组访视3的D-D较同组基线降低，对照组访视2、访视3的D-D较同组基线上升，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

自2008年，胶州市开展优质生产示范区项目，进行胶州市大白菜试验中心建设。胶州市联合胶州大白菜协会，从育种、种子、收获、包装等环节对胶州大白菜进行优化。截止2010年底，有4家胶州大白菜种子开发企业注册资金超过550万元，有6家胶州大白菜加工企业其加工能力超过1200吨。

表1 2组不同时点凝血指标比较

2.2 2组患者TF比较

2组基线时TF水平差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后，试验组TF水平较对照组低，但差异无统计学意义(P>0.05); 2组TF水平均较本组基线下降，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 2组TF表达比较

2.3 2组患者炎症因子比较

2组基线时IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平的差异无统计学意义(P>0.05); 治疗后，与对照组比较，试验组访视3的IL-1β、TNF-α降低，其中2组访视3的IL-1β差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组炎症因子比较 pg/mL

2.4 2组患者血小板聚集试验对比

治疗后，试验组访视3的血小板聚集性低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05); 试验组访视3的血小板聚集性较基线降低，对照组访视3的血小板聚集性较基线上升，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 2组血小板聚集试验比较 %

2.5 凝血指标与TF相关性分析

将2组基线的D-D、FIB与TF进行相关性分析，发现FIB与TF呈显著正相关(r=0.447,P=0.001)。见表5。

表5 D-D、FIB与TF的相关性分析

2.6 试验组治疗后FIB与TF水平变化的相关性分析

取试验组治疗后FIB与TF水平的变化进行相关性分析, FIB水平变化为(-0.20±0.77) mg/L(n=22), TF水平变化为(-39.46±39.85) ng/L(n=22), 结果显示FIB与TF治疗后的水平改变呈显著正相关(r=0.433,P<0.05), 说明健脾化瘀方可能通过降低TF实现降低FIB的目的。

2.7 凝血指标与炎症因子的相关性分析

将2组基线的D-D、FIB与炎症因子进行相关性分析，发现FIB与IL-1β呈显著正相关(r=0.357,P=0.013), 见表6。

表6 D-D、FIB与IL-1β的相关性分析

2.8 试验组治疗后FIB与IL-1β水平变化的相关性分析

取试验组治疗后FIB与IL-1β指标的变化进行相关性分析, FIB水平变化为(-0.18±0.76) mg/L(n=13), IL-1β水平变化为(-9.45±20.91) ng/L(n=13), 结果显示FIB与IL-1β治疗后的水平改变呈正相关(r=0.555,P=0.049)。

2.9 安全性

试验组与对照组治疗后白细胞减少(P=0.655)、血红蛋白减少(P=0.250)、血小板减少(P=0.564)、转氨酶比升高(P=0.927)、肌酐升高(P=0.333)、恶心呕吐(P=0.686)、腹泻(P=0.255)等不良反应发生率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表7。

表7 2组治疗后安全性指标比较

3 讨 论

目前国内外肿瘤治疗指南[17]均建议，对于不存在抗凝禁忌的肿瘤患者，应预防性抗凝治疗。然而，考虑到抗凝药物的使用禁忌(如胃黏膜、胃瘤体的出血风险高，抗凝药物与部分胃癌化疗药物同时使用存在禁忌)，预防性抗凝常难以有效实行，临床多于血栓出现后才干预。研究[18]显示中医药既可改善高凝状态，又不易引发不良事件，并具备多靶点、可长期服用等优势。

健脾化瘀方为本院肿瘤科根据晚期胃癌患者脾胃气虚为本、瘀毒互结为标的病机特点所拟定的经验方。前期研究[19-23]显示，健脾化瘀方可改善患者的生活质量，减轻化疗的毒副反应，抑制胃癌细胞增殖、侵袭、转移并诱导凋亡。现代药理研究[24-25]证实，方中丹参、三七粉、三棱、莪术可通过抗血小板聚集、抑制血小板活化、干预凝血级联反应等途径发挥抗血栓作用，党参、黄芪、白术、茯苓、薏苡仁可通过抑制促血管生成因子的表达而下调IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β等炎症因子分泌，抑制淋巴管和血管生成，调节肿瘤细胞炎性微环境[26-28]。

本研究发现，健脾化瘀方可以降低试验组患者的D-D、FIB水平，延长TT时间，直接改善患者的血液高凝状态; 同时，还可降低TF水平，TF可激活凝血因子，启动内、外源性凝血酶联，诱导血管内皮生长因子(VEGF)的表达[29-30], 是造成血液高凝状态的重要因子。健脾化瘀方还可降低IL-1β、TNF-α的水平。IL-1β可诱导内皮细胞表面的黏附分子表达，介导单核细胞与血小板相互黏附，介导中性粒细胞向血管内皮细胞迁移、黏附，促进血栓形成，并可抑制蛋白C和组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的分泌，抑制纤溶，促进高凝[31-33]。TNF-α可通过激活单核细胞表达TF启动凝血机制，活化血小板，抑制内皮细胞表达抗凝调节蛋白，促进凝血形成血栓[34]。

本研究对凝血指标与TF、凝血指标与炎症因子进行了相关性分析，结果显示，凝血指标FIB与TF、IL-1β均呈显著正相关，其水平的下降亦呈正相关。分析原因为: ① 健脾化瘀方具备改善血液高凝状态和慢性炎症的能力，可同时影响FIB、D-D、TT，降低炎症因子IL-1β、TNF-α的表达，证实本方具有综合抗凝治疗的潜力; ② 凝血指标中的FIB水平与TF水平呈显著正相关，经健脾化瘀方治疗后，FIB与TF水平下降亦呈正相关，提示TF所介导的促凝途径可能造成FIB的增加，而致血液高凝，而健脾化瘀方可能通过降低TF的表达影响其所介导的促凝途径; ③ 凝血指标中的FIB水平与炎症因子IL-1β水平呈正相关，提示血液高凝状态与慢性炎症存在相关性，治疗后FIB与IL-1β水平的下降呈正相关，提示健脾化瘀方可能通过干预慢性炎症因子IL-1β而改善血液高凝状态; ④ FIB与TF、IL-1β均具有相关性，是诊断胃癌血液高凝状态和疗效评价的重要指标。