肠道菌群失调在孤独症谱系障碍发生发展中作用和机制的研究进展

顾友余，张碧，秦炯

(北京大学人民医院儿科，北京 100044)

孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD)是一组婴幼儿期起病的神经发育障碍性疾病，其典型临床特征包括社交障碍、兴趣狭窄以及重复性、刻板性动作或行为，部分患者伴有语言障碍。ASD可分为典型孤独症、不典型孤独症、阿斯伯格综合征等亚型。ASD根据症状严重程度不同分为轻度、中度以及重度。近年来，全球ASD发病率逐年增高，全世界8岁儿童ASD的预期发病率高达14.6‰[1]，美国儿童ASD发病率约为1/68[2]，我国儿童ASD发病率约为1%[3]。

目前ASD的病因和发病机制尚不清晰，也缺乏有效的治疗手段。研究发现，某些特定区域的染色体重排(如15q11～q13、16p11.2)以及某些特定类型的基因突变[如SYNGAP1(Synaptic Ras GTPase-activating protein 1)基因、电压门控2A型钠离子通道基因、染色体结构域解旋酶DNA结合蛋白8基因]与ASD的发生密切相关[4]；妊娠期服用抗癫痫药物(丙戊酸钠)[5]、宫内感染[6]、多囊卵巢综合征[7]以及环境污染[8]等均可显著增加胎儿出生后罹患ASD的概率；有某些遗传性神经系统疾病(如结节性硬化症、脆性X综合征、神经纤维瘤病Ⅰ型)的患儿也可出现ASD的临床症状[4]；此外，不同性别的ASD患病率不同，男童患病率是女童的4倍以上[1-2]，提示女性体内可能存在抑制ASD发生发展的特异性物质。与健康对照者相比，ASD患者的肠道菌群及其代谢产物的数量和组成发生显著改变[9-11]；调控肠道菌群可在一定程度上改善ASD患者的临床症状[12]，提示肠道菌群失调与ASD的发生发展密切相关。现就肠道菌群失调在ASD发生发展中的作用以及相关的分子机制予以综述。

1 肠道菌群及其主要代谢产物

肠道菌群是寄居在人体胃肠道内的微生物族群，其总数可达1014个，是人体细胞总数的10倍以上。肠道菌群具有调控机体消化、吸收、排泄、免疫、氨基酸合成和分解、胆汁酸代谢以及维生素合成等生理功能的作用[13-15]。人体肠道菌群主要分为革兰阳性厚壁菌门、革兰阴性拟杆菌门、放线菌门以及变形菌门4类，其中前两者占总数的90%以上。

肠道菌群的主要代谢产物包括短链脂肪酸、游离氨基酸以及一些神经递质。短链脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸等，在人体内所占比例约为60∶20∶20，是肠道内微生物发酵膳食纤维得到的代谢产物[16]。大约95%的短链脂肪酸被结肠吸收，其中乙酸通过血液循环进入肝脏，作为重要的底物参与胆固醇合成；丙酸进入肝脏后参与糖脂代谢，并抑制胆固醇的合成；丁酸直接被结肠上皮细胞吸收，是结肠上皮细胞的主要能量来源[17]。此外，肠道菌群还参与机体蛋白质代谢，为自身生长提供氮源，也为机体合成必需氨基酸。游离氨基酸是肠道内未消化的蛋白质和多肽在肠道菌群的作用下分解得到的产物，其数量和组成可反映肠道菌群的功能。其中一部分氨基酸(如谷氨酸、色氨酸和酪氨酸)也可作为神经递质或前体。肠道菌群参与合成和分泌的神经递质还包括多巴胺、5-羟色胺、γ氨基丁酸以及去甲肾上腺素等[18]。

2 肠道菌群失调在ASD发生发展中的作用和机制

近年来，随着对肠道菌群和中枢神经系统研究的不断深入，“脑-肠-微生物轴”理论正在被越来越多的人所接受。这一理论认为，中枢神经系统与肠道之间通过神经内分泌系统、神经免疫系统以及迷走神经系统双向调控，肠道菌群及其代谢产物在其中起着重要的媒介作用[19-20]。因此，肠道又被称为“第二大脑”。调控肠道菌群及其代谢产物可能有助于治疗包括ASD在内的多种难治性中枢神经系统疾病。下文从脑-肠-微生物轴的神经内分泌系统、神经免疫系统以及迷走神经系统3个方面对肠道菌群及其代谢产物改变在ASD发生发展中的作用和机制进行阐述。

2.1神经内分泌系统 下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamus-pituitary-adrenocortical axis,HPA轴)和交感肾上腺髓质系统分别合成糖皮质激素和儿茶酚胺，参与调控人体应激反应[21]。下丘脑室旁核的小细胞性神经元接受刺激合成并释放促肾上腺皮质激素释放激素至垂体，与垂体促肾上腺皮质激素释放激素受体1结合，激活促肾上腺皮质激素的前体物质阿黑皮素原，加速促肾上腺皮质激素的合成并作用于肾上腺，促进肾上腺合成并释放皮质醇[22]。与此同时，交感肾上腺髓质系统也被激活，儿茶酚胺类物质肾上腺素和去甲肾上腺素大量合成释放。皮质醇、肾上腺素和去甲肾上腺素共同作用可引起机体血糖升高、免疫抑制以及脂肪蛋白质代谢增强等一系列应激反应。之后肾上腺发出负反馈信号，抑制下丘脑和垂体的相关激素分泌，减轻应激反应。

肠道菌群对HPA轴的发育和生理功能具有重要、不可替代的调控作用[23]。动物实验发现，无菌大鼠和无菌小鼠受到外界压力后，HPA轴活性显著升高，菌群移植可部分改善这一症状[24-25]。在垂体，肠道菌群能够抑制糖皮质激素受体敏感性基因(FK506结合蛋白基因)的表达；在肾上腺，肠道菌群可抑制编码类固醇生成的黑皮质素受体2基因、类固醇生成急性调节蛋白基因以及细胞色素P450家族成员11A1基因的表达[26]。新生儿期HPA轴尚未发育完全，皮质醇含量异常以及围生期应激反应等可引起新生儿肠道菌群数量和组成发生改变[27-28]，导致下丘脑室旁核基因表达改变以及肾上腺皮质酮释放增多，进而影响HPA轴的发育[29]。出生后母婴分离的子代鼠肠道通透性增加以及血浆皮质酮水平显著升高，使用益生菌Bifidobacterium bifidum G9-1治疗能够显著改善上述症状[30]，提示调控肠道菌群可改善HPA轴发育及功能异常。此外，肠道菌群的代谢产物5-羟色胺能够调控下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素的分泌，5-羟色胺受体表达改变可影响HPA轴的功能[31]。

ASD与HPA轴功能异常之间存在密切联系。动物实验发现，母鼠孕中期腹腔注射丙戊酸诱导的子代雄性孤独症模型小鼠肾上腺皮质酮水平显著升高[32]。临床研究发现，未共患其他神经精神系统疾病的ASD患者唾液皮质醇水平显著降低[33-34]，血浆5-羟色胺水平显著升高[35]；特里尔社会压力测试结果显示，ASD患儿接受外界刺激后，唾液皮质醇水平未显著升高[36]。然而，有临床研究得出了相反的结论，如Corbett等[37]研究发现ASD患儿皮质醇昼夜节律变化较大，接受外界刺激后皮质醇水平显著升高；Spratt等[38]的研究结果与Corbett等[37]相似。ASD患者普遍存在肠道菌群失调，推测肠道菌群可能通过调控HPA轴影响ASD的病程，但具体机制尚不清晰，需要进一步研究。

2.2神经免疫系统 肠道菌群及其代谢产物构成了肠黏膜的化学和生物屏障，参与免疫系统的发育和调节。肠道菌群在T细胞的发育、分化以及维持免疫系统平衡方面具有重要调控作用，可维持辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞)17/调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)的动态平衡[39]。分段丝状细菌的鞭毛蛋白参与诱导肠道内Th17细胞，影响白细胞介素(interleukin,IL)-17相关信号通路基因(IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α、IL-17A、IL-17F和IL-22)和上皮细胞特异性基因(诱导型一氧化氮合酶、双氧化酶2、双氧化酶成熟因子2、血清淀粉样蛋白启动子、反式激活因子和脂质运载蛋白2)的表达[40-41]。ASD患儿Th17与Treg细胞的动态平衡被打破，Th细胞(包括Th1、Th2和Th17细胞)数量增加、Treg细胞数量减少，且Th17/Treg细胞比值与ASD症状的严重程度呈正相关[42-43]。上述研究结果提示，ASD的发生发展可能与肠道菌群对免疫细胞(特别是T细胞)的异常调控有关，但具体机制有待进一步研究。

除直接调控T细胞的发育和分化外，肠道菌群失调还可能通过影响肠道黏膜屏障及血脑屏障的完整性间接调节免疫系统。肠道菌群失调可引起肠道上皮细胞间紧密连接蛋白(包括闭锁连接蛋白-1、闭锁蛋白和供紧密连接蛋白-1)表达减少[44]，肠道黏膜通透性增加[45]，大量的毒素、细菌及其组成成分和代谢产物(如脂多糖)通过受损的肠道壁进入血液循环，引起系统性炎症反应[46-47]；同样，肠道菌群失调与脑组织紧密连接蛋白(包括闭锁蛋白和供紧密连接蛋白-5)表达减少密切相关，这一改变可引起血脑屏障通透性增加[48]；系统性炎症反应时，血液循环中的炎症因子可结合在肠道黏膜上皮细胞和脑血管内皮细胞表面，激活Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)，引起肠道黏膜上皮细胞和脑血管内皮细胞发生炎症反应，加重肠道黏膜屏障和血脑屏障损伤[49-51]；之后炎症因子通过受损的血脑屏障进入中枢神经系统[52]。其中IL-1β和肿瘤坏死因子-α可结合在神经元表面，引起小胶质细胞过度激活及神经炎症反应[53-55]。

大量研究发现，ASD患儿血浆和脑脊液中炎症因子水平显著升高[56-57]；而一些具有抗神经炎症作用的物质(如维生素D、萝卜硫素、白藜芦醇、催产素)在ASD的相关临床试验中取得了一定疗效[58]；上述研究结果提示，系统性炎症反应和神经炎症反应在ASD的发生发展过程中可能具有重要作用。Tomova等[59]对来自斯洛伐克的63例ASD男童及27例健康对照男童的粪便进行肠道菌群高通量二代测序，发现ASD男童存在严重的肠道菌群失调，多达87种肠道微生物的丰度与健康对照相比存在差异；其中Bilophila和Carboxydothermus的丰度与小胶质细胞释放的炎症因子S100B表达呈负相关，提示小胶质细胞活化可能在ASD发生发展中具有重要调控作用。甘露醇/乳果糖试验证实，与健康对照者相比，ASD患儿肠道黏膜通透性显著增加[60]；对ASD患者和非ASD患者的遗体进行尸检发现，与非ASD患者相比，ASD患者肠组织和脑组织多种紧密连接蛋白表达水平显著改变，肠黏膜屏障和血脑屏障受到破坏[61]，提示肠道菌群可能通过影响肠黏膜屏障和血脑屏障，引起系统性炎症反应和神经炎症反应，导致ASD的发生发展。

但目前仍存在一些问题有待进一步研究，如肠道菌群调控免疫细胞发育和分化的分子机制；肠道微生物数量和组成改变引起紧密连接蛋白表达下调的分子机制；除肠黏膜屏障和血脑屏障受到破坏外，系统性炎症反应的其他影响因素以及神经炎症反应与孤独症样行为之间的具体关系等。

2.3迷走神经系统 迷走神经系统是肠道菌群调控中枢神经系统最快、最直接的途径[62]。胃肠道黏膜上分布着超过1亿个神经元，这些神经元组成了肠神经系统。其中迷走神经受体可感受肠道菌群及其代谢产物的变化，通过迷走神经将信号传递给中枢神经系统；中枢神经系统接收信号后会产生兴奋并通过迷走神经反向传递给胃肠道黏膜神经元，调控胃肠道的功能[63]。肠道菌群代谢产生的神经递质(如多巴胺、5-羟色胺、γ氨基丁酸)通过迷走神经系统引起中枢神经系统神经元兴奋或抑制[64]。

肠道菌群代谢产物数量和组成的改变可通过影响迷走神经系统引起宿主孤独症样行为。Liu等[65]对来自河南郑州的30例ASD儿童及20例健康对照儿童的粪便进行肠道菌群16S核糖体RNA测序及代谢产物鉴定发现，与健康对照儿童相比，ASD儿童粪便中乙酸、丁酸含量较低，且产丁酸菌(Ruminococcaceae、Eubacterium、Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae)相对丰度显著偏低。而肠道菌群的代谢产物丙酸通过调控多巴胺和5-羟色胺引起大鼠社交功能障碍[66]；丁酸通过改变酪氨酸羟化酶基因的表达调控多巴胺的分泌[67]；提示肠道菌群失调通过影响其代谢产物的数量和组成，传递信号给迷走神经系统，进而调控孤独症样行为。与健康对照者相比，ASD患儿粪便中短链脂肪酸、游离氨基酸以及氨的含量显著升高[68]，尿色氨酸含量显著升高，尿缬氨酸含量显著降低[69]，血浆5-羟色胺及γ氨基丁酸含量显著升高[37]，脑组织5-羟色胺含量显著降低[70]。接受迷走神经刺激术治疗的ASD患者核心症状得到显著改善[71]，提示肠道菌群失调可能通过影响迷走神经系统的功能引起ASD的相关症状。

3 结 语

ASD是一类累及多系统、涉及多靶点的难治性神经发育性疾病，使用单一作用靶点的药物进行治疗难以取得良好的效果。此外，肠道菌群在不同个体和不同群体之间的差异较大，且受到多种因素(如性别、年龄、种族、饮食习惯、家庭条件、受教育程度以及卫生情况)的影响。因此，根据每例ASD患者自身的肠道菌群及其代谢产物特点，实行个体化精准治疗可能成为研究热点。未来需进一步了解每种肠道菌群及代谢产物的生理作用，在此基础上探索不同菌群、不同代谢产物之间以及菌群与代谢产物之间的相互作用关系，并运用生物信息学技术探索肠道菌群及其代谢产物改变引起ASD发生发展的信号转导通路，从而开发出新的、个体化的治疗药物和治疗手段，实现ASD的精准治疗。