3D 打印技术制备骨科植入材料聚醚醚酮的力学性能研究及氨基改性对材料成骨性能的影响

赵丙辉 李沅 李文娇 天津市医疗器械质量监督检验中心 （天津 300384）

内容提要：目的：探讨3D打印技术制备骨科植入材料聚醚醚酮（PEEK）的力学性能及氨基改性对材料成骨性能的影响。方法：应用3D打印技术制作骨科植入材料PEEK，通过单轴压缩、单轴拉伸及三点弯曲实验对其生物力学性能进行检测。对样品进行低温等离子表面改性，通过对成骨细胞增殖、形态及碱性磷酸酶（ALP）活性检测来分析氨基改性对材料成骨性能的影响。结论：3D打印制备PEEK作为创伤骨科植入物具有稳定、优良、卓越的力学性能、化学性能和生物相容性，而通过在其表面引入氨基团能够进一步提高材料的成骨性能。

聚醚醚酮（PEEK）是一种具有良好化学和热稳定性的高强度、高熔点及优异的加工性能的芳香族的特种工程塑料材料。PEEK于1960年由美国杜邦和英国ICI联合研制成功，1980年以来开始作为新型植入物被广泛应用于骨折固定、脊柱外科、整形外科骨缺损修复、关节置换等领域[1]。相比纯钛，PEEK的弹性模量与骨组织更为接近，其力学性能更优良，化学性能更稳定，生物相容性也更优越[2]。上世纪90年代以来，快速原型技术（RP）得到快速发展，3D打印技术的应用不仅能实现植入材料的个体化定制，还进一步提高了材料的适应性和稳定性。但PEEK仍属于一种不利于和周围骨组织形成良好骨性结合的生物惰性材料，而且其机械性还需要进一步提高[3]。因此，本研究主要是对3D打印技术制备骨科植入材料PEEK的力学性能及氨基改性对材料成骨性能的影响进行探讨分析，为其临床应用领域的拓展提供依据。

1.材料与方法

1.1 样品材料

PEEK（型号Jugao-MT45，陕西巨高增材医疗科技有限公司），所有样品表面均经SiC水磨砂纸逐级抛光（240目、600目、800目、1200目、2000目），分别采用丙酮、无水乙醇和去离子水清洗，时间为15min，之后放在烘箱中于50°C下干燥，于干燥皿中保存。

1.2 3D打印标准件制备

打印3D打印标准件，使用专用PEEK骨科植入物打印机进行操作，成型方式采用熔融沉积成型（FDM），依照国际弯曲实验、压缩实验和拉伸实验的要求制备标准试件，保证试件无扭曲，表面和边缘应无划痕、凹陷、毛刺和空洞，相邻平面相互垂直。

1.3 方法

1.3.1 力学性能测试

应用电子静态力学试验机（Instron 3345）。实验室温湿度分别为（23±2）°C和（50±5）%RH，实验重复进行5次，具体参数为：单轴压缩实验参照标准GB/T1041-2008进行，采用A型试件作为压缩模量试件，采用B型试件作为25%应变对应的压缩强度试件，测试速度为1mm/min；三点弯曲实验的参照标准为GB/T9341-2008，跨距69mm，测试速度2mm/min；单轴拉伸实验参照GB/T1040.1-2006&GB/T1040.2-2006标准进行，试件为1BA型，拉伸模量和拉伸强度的测试速度分别为1mm/min和5mm/min，初始夹具间距分别为60mm和65mm。

1.3.2 样品表面改性

对PEEK材料样品进行低温等离子表面改性，反应室的标准激发频率为13.56MHz，基础压强<1×103Pa（开始放电前）。首先对样品表面应用氩气进行清洁和活化，参数为：压强为5×10-2Pa，连续波50W，10s，之后对材料表面分别在连续波和偶连脉冲模式下用烯丙胺进行辉光放电等离子改性，具体参数为：连续波的射频功率和时间分别为45W和10min，脉冲的平均功率为13.5W，占空比3/10，时间为30min。

1.3.3 氨基标定与检测

应用4-三氟甲基苯甲醛（TFBA）对氨基进行标定，2h后进行材料表面元素测定，检测仪器为X射线光电子能谱仪，检测元素为碳元素、氧元素、氟元素和氮元素。

1.3.4 成骨性能检测

成骨细胞培养及4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色：在37°C、5%CO2恒温培养箱进行MG-63成骨细胞孵育，应用含2%胎牛血清的高糖DMEM培养液（H-DMEM完全培养液）培养，待细胞生长至80%～90%时，用胰蛋白酶消化，传代。将MG-63称骨细胞接种至24孔板中的样品表面（实验前紫外线照射至少30min）培养，6h后用PBS缓冲液冲洗，重复3次，冲洗后用4%多聚甲醛固定10min，用DAPI染料染色10min，弃去PBS液，清洗5min，连续3次，用显微镜观察细胞的黏附情况。

扫描电镜观察：在24孔板中的样品表面接种MG-63成骨细胞进行培养，培养时间为6h，之后用2.5%戊二醛进行固定，时间为12h。用PBS液充分冲洗样品，3次×15min，不同梯度乙醇脱水，风干、喷金后用扫描电镜进行观察。

细胞增殖检测：在24孔板中的样品表面接种MG-63成骨细胞进行培养，分别在培养第1天和第7天后，加入人胆囊收缩素/缩胆囊素八肽（CCK-8）试剂，体积比为10:1，用酶标仪在450nm波长下检测吸光光度值。

碱性磷酸酶（ALP）活性检测：在24孔板中的样品表面接种MG-63成骨细胞进行培养，分别在培养第7天和第14天时进行ALP活性检测：用PBS液重复冲洗3次，加入0.1%Triton-X，放置在冰箱中，4°C下裂解40min，之后检测总蛋白量，应用二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（碧云天生物技术研究所提供）进行检测，再进行ALP量检测，采用ALP试剂盒（京中生生物工程高技术公司提供）检测，根据试剂盒说明书进行操作并计算ALP活性。

1.4 统计学分析

2.结果

2.1 力学性能测试结果

力学性能测试结果显示：单轴拉伸性能检测显示拉伸模量为（3742.60±271.92）MPa，拉伸强度为（96.02±1.71）MPa；单轴压缩性能检测显示压缩模量和压缩强度分别为（2782.30±128.35）MPa和（143.08±7.16）MPa；三点弯曲性能检测结果显示弯曲模量和弯曲强度分别为（3577.70±133.81）MPa和（139.46±2.09）MPa。

2.2 氨基改性对材料成骨性能的影响

XPS分析结果显示，PEEK样品表面在氨基改性前仅含有氧和碳两种元素，氨基改性后可检测到氟元素和氮元素，说明等离子体氨基改性在材料表面引入了氨基。DAPI染色后在扫描电镜下观察可见，成骨细胞在经改性后的PEEK材料表面上黏附增多（见图1），细胞在材料表面呈梭形，扁平状，伸展较好，板状伪足向材料表面伸展（见图2）。培养1d和7d时，经改性后的PEEK材料的OD值较改性前均明显增加；培养7d和14d时，经改性后的PEEK材料的ALP活性较改性前也明显升高，比较差异均有统计学意义（P<0.05）（见表1）。

图1.MG-63成骨细胞在材料样品表面培养6h后的DAPI染色结果

图2.MG-63成骨细胞在材料样品表面培养6h后细胞形态

表1.经氨基改性前后细胞增殖能力和ALP检测结果比较(±s)

表1.经氨基改性前后细胞增殖能力和ALP检测结果比较(±s)

注：与改性前比较，aP<0.05

时间 OD值 ALP活性培养1d 培养7d 培养7d 培养14d改性前 0.21±0.06 0.47±0.11 0.24±0.03 0.63±0.17改性后 0.36±0.08a 0.63±0.14a 0.34±0.04a 0.76±0.08a

3.讨论

从生物力学角度来看，相比金属植入体（180GP），PEEK材料的弹性模量（3-4GP）与皮质骨（约18GP）更为接近，通过对含碳纤维PEEK碳纤维长度和方向进行调节，该材料的弹性模量可达到与皮质骨相同的程度。钛等传统金属生物材料的弹性模量很高，容易引发应力遮蔽作用，导致种植体边缘骨质流失而出现松动和脱落，并为细菌的侵入提供了路径。相较而言，PEEK的弹性模量与骨组织更为激进，其对骨组织和植入物之间骨结合的牢固性和稳定性更有益。研究显示，PEEK材料在一定温度条件下，在不同且持续应力等级的拉伸中不会产生明显蠕变，其经过一万次循环的拉伸疲劳测试后仍能维持高强度的力学性能[4]。而且，PEEK还是具有优良摩擦学性能的自润滑材料，摩擦系数较超高分子量的聚乙烯复合材料明显降低，在填充碳纤维或其他材料后磨损率会进一步显著降低。从化学结构角度来看，PEEK结构的稳定性极高，其是由苯环通过酮键和醚键在对位连接而成，因此具有热稳定性、化学稳定性和射线稳定性，可反复经γ射线、高压、高温消毒。已经有大量实验数据证实，PEEK材料在肌肉内植入测试和皮下毒性测试中均显示出无任何致癌致畸毒性，有很好的生物相容性[5,6]。而钴铬合金、钛合金等临床应用最多的传统金属骨替代生物材料，因为材料本身的退变和在生理酸碱性条件下会释放金属离子，往往引起植入物修复失败。

从制造方法角度看，PEEK材料目前主要存在热塑成型、机械加工和3D打印3种加工方法。热塑成型是可用于形状复杂部件加工和生产的传统高分子材料加工工艺，尤其是批量生产，但其在个性化材料的设计和制作优势不足，工序复杂且繁琐，花费时间长，成本高，经济性差。机械加工也具有成本高的缺点，而且其对材料的利用率较低。而3D打印技术是一种以数字模型文件为基础的构造物体技术，其通过在立体模型上勾勒出以CT或MRI数据为依据的几何形态，进行区域重建，并通过逐层精确堆积材料来最终构造出所需的物体，该制作工艺最大的优点能在实现复杂形状结构精密成形的基础上定制出个体化的植入材料，具有很高稳定性配适性[7]。本研究中使用PEEK骨科植入物3D打印机并采用FDM成型方式制备PEEK材料样件，通过力学性能测试显示，3D打印材料的拉伸强度、抗压能力、抗弯能力均处于较高水平，其拉伸强度与皮质骨接近，压缩强度与皮质骨基本一致，抗弯强度则明显高于皮质骨。

尽管PEEK材料的机械性能、可加工性和稳定性都较好，但其属于生物惰性材料，其机械性能和骨结合能力比纯钛都更低，这会极大地影响其临床应用的范围。低温等离子表面改性技术是一种较为先进的新型材料表面改性技术。等离子体指完全或部分电离气体，是物质的第四态，而低温等离子体是在高能量放电（包括辉光放电、直流电弧放电、电晕放电、微波放电、射频放电等）的条件所产生的包含大量不同类型粒子（电子、离子、原子、自由基、分子等）的部分电离气体，这些大量存在的不同类型粒子会产生极其复杂的相互作用，从而能使一些普通情况下难以实现的事被完成。低温等离子表面改性具体是在高能量的电流放电状态下，将挥发的气态的单体化学键打断，然后这些化学键在材料表面以共价键形式重组、结合，形成新的化学成分和结构，而且这些结构有不同的活性功能层。该方法能处理各种不同形状的材料表面，通过在低温处理过程中引入占空比、脉冲等能对单一有机分子产生激活作用，同时不会对其基本化学功能产生破坏作用，不改变材料基体性质，进而使表面具有稳定性、功能性和高特异性的特点，还具有强大的杀菌作用。氨基表面带正电荷，其活血反应活性良好，被广泛应用于水环境中蛋白质等生物分子的偶连[8]。有研究指出，氨基改性有利于促进称骨细胞和神经胶质细胞在纯钛表面的黏附和增殖，材料的成骨活性也大大提高[9]。本研究结果显示，PEEK材料表面成骨细胞黏附增多，表面称骨细胞呈偏平状，伸展较好，细胞OD值明显增加，且ALP活性明显升高。提示氨基改性有利于称骨细胞在材料表面的增殖和分化，细胞的黏附数量增加，伸展形态增强，细胞增殖能力升高，同时对材料表面称骨细胞具有促进其早期分化的作用，但这种作用的具体机制尚不明确，需进一步研究。

综上所述，3D打印制备PEEK作为创伤骨科植入物具有稳定、优良、卓越的力学性能、化学性能和生物相容性，而通过在其表面引入氨基团能够进一步提高材料的成骨性能。