薯蓣丸调控HIF-1α与p53表达改善线粒体损伤治疗肝细胞癌的实验研究

邓哲 欧阳昭广 胡玉星 冯婷 陈铮甲 宁迪敏 张博宇 雷宜晨 刘华 田雪飞

〔摘要〕 目的 觀察薯蓣丸对肿瘤微环境中HIF-1α与p53的表达以及线粒体损伤的影响，及其对肝细胞癌的治疗作用。方法 制备人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，雄性BALB/c裸鼠（n=24， 5周龄），随机分为4组，每组6只：模型组（0.9%生理盐水0.2 mL/d）、薯蓣丸组（薯蓣丸0.4 g/d），薯蓣丸+顺铂组（薯蓣丸0.4 g/d+每周腹腔注射顺铂5 mg/kg）、顺铂组（每周腹腔注射顺铂5 mg/kg）。每只裸鼠灌胃剂量为0.2 mL/d，每2天测量1次肿瘤体积与小鼠体质量，连续干预14 d后脱颈处死，剥离皮下移植瘤;电镜下观察肿瘤组织线粒体结构和数量;Western blot与RT-qPCR法分别检测人肝癌裸鼠皮下移植瘤中HIF-1α、p53的蛋白及mRNA表达。结果 与模型组相比，薯蓣丸组可抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生长，抑制HIF-1α的mRNA与蛋白表达（P<0.05），上调抑癌基因p53的mRNA与蛋白表达（P<0.05），同时改善线粒体结构损伤;与薯蓣丸组或顺铂组相比，薯蓣丸联合顺铂组对HIF-1α、p53基因表达及改善线粒体结构作用更显著（P<0.05）。结论 薯蓣丸可通过促使HIF-1α的失活与p53的活化，改善线粒体结构损伤，从而抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生长，与顺铂联用后具有协同增效作用。

〔关键词〕 肝癌;肿瘤微环境;薯蓣丸;线粒体损伤;HIF-α;p53

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.007

〔Abstract〕 Objective To evaluate the effect of Shuyu Pills on the expression of HIF-1α and p53 in tumor microenvironment and mitochondrial damage， and therapeutic effect on treating hepatocellular carcinoma （HCC）. Methods The subcutaneously transplanted tumor model of human hepatocellular carcinoma in nude mice was prepared. Male BALB/c nude mice （n=24， 5 weeks old） were randomly divided into 4 groups with 6 mice in each group： model group （administered normal saline， 0.2 mL/d）， SYP group （0.4 g/d Shuyu Pills）， SYP+DDP group （0.4 g/d Shuyu Pills + weekly intraperitoneal dose of 5 mg/kg cisplatin）， DDP group （weekly intraperitoneal dose of 5 mg/kg cisplatin）. Each mouse was taken 0.2 mL drug via gavage every day. The tumor volume and body weight of mouse were measured every 2 days. After continuous intervention for 14 days， all the mice were sacrificed by neck removal and subcutaneous graft tumor was removed; the structure and quantity of mitochondria in tumor tissues were observed by electron microscopy; the protein and mRNA expression levels of HIF-1α and p53 of tumor were detected by Western blot and RT-qPCR. Results Compared with model group， SYP group inhibited the growth of subcutaneous transplanted tumor of HCC in nude mice， inhibited the mRNA and protein expression of HIF-1α （P<0.05）， upregulated the mRNA and protein expression of tumor suppressor gene p53 （P<0.05）， and improved the mitochondrial structure damage; compared with SYP group or DDP group， SYP+DDP group improved the expression of HIF-1α and p53 genes and mitochondrial structure significantly （P<0.05）. Conclusion Shuyu Pills could inhibit the growth of subcutaneously transplanted human HCC in nude mice， which might inactivate HIF-1α and activate p53， to improve mitochondrial structural damage， combined with cisplatin， Shuyu Pills has synergistic effect.

〔Keywords〕 hepatocellular carcinoma; tumor microenvironment; Shuyu Pills; mitochondrial damage; HIF-1α; p53

肝细胞癌（hepatocarcinoma， HCC）是临床常见的恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率分别位居全球恶性肿瘤第6位与第4位[1]。缺氧是实体瘤中的常见现象，可诱导肿瘤能量代谢重编程[2]。代谢异常是肿瘤的重要特征，正常细胞在氧气充足的情况下利用线粒体的氧化磷酸化产生ATP，为细胞的生命活动提供能量，而在氧气不足的情况下则转变为利用糖酵解的方式。在多数肿瘤中，无论处于有氧还是缺氧环境，都要保证一定程度的糖酵解反应作为产能方式，这被称为有氧糖酵解过程，即Warburg效应，也是肿瘤细胞独有的代谢特征之一[3]。肿瘤细胞糖酵解过程不仅为肿瘤细胞提供维持生长的能量，其合成的乳酸、核苷酸等一系列产物还为肿瘤细胞增殖、转移过程提供了必需的内源性生物原料[4]。也有研究[5]认为是因为肿瘤细胞中线粒体含量减少了20%～50%的原因导致OXPHOS的降低，这一理论进一步扩展支持了Warburg的假说。线粒体的代谢受一系列基因的调控，肿瘤发生的早期处于缺氧微环境，使得HIF-1、p53、NF-κB等基因的表达变化，导致线粒体的氧化磷酸化受到抑制，细胞主要以糖酵解的形式获得能量[6-7]。肝脏作为一个高度再生的器官，肝细胞中包含大量的线粒体以供能，线粒体代谢重编程在肝癌发生发展中起重要作用，肝脏线粒体代谢异常是公认的致癌因素之一[8]。因此，抑制肿瘤缺氧相关基因的表达，改善线粒体的损伤，有助于抑制肿瘤细胞的有氧糖酵解，恢复线粒体的氧化磷酸化功能，抑制肿瘤的进展。

低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1， HIF-1α）是HCC细胞适应低氧微环境的重要调节因子，影响HCC细胞的生长繁殖、侵袭转移、血管新生、耐药、凋亡等过程[9-10]。研究[2]发现，HIF-1α的表达可降低线粒体的合成，从而导致细胞氧耗的减少。另外，抑癌基因p53的突变、表达下调或缺失，也可作用于线粒体代谢，使线粒体呼吸转变为糖酵解模式[11]。因此，抑制HIF-1α的表达与p53的失活，有望改善肝癌细胞线粒体代谢重编程，抑制糖酵解的发生。研究[12]发现，脾虚模型大鼠中多器官的线粒体含量明显减少，形状异常，结构紊乱，基质改变。通过改善脾虚进而改善线粒体在脏器中的合成与代谢，有望从改善代谢方式的角度控制肿瘤的进展。而线粒体生物合成、能量代谢功能的正常发挥与中医“脾为后天之本”的功能密切相关[12-13]，薯蓣丸出自东汉张仲景《金匮要略·血痹虚劳病》：“虚劳诸不足，风气百疾，薯蓣丸主之”，功用健脾益气和营，因脾气亏虚导致的虚劳百疾皆可用之。现代研究[14-15]表明，薯蓣丸具有改善能量代谢与免疫功能、辅助治疗肿瘤等多个方面的作用。为了探究薯蓣丸是否通过保护线粒体发挥调控HCC细胞能量代谢的作用，我们将薯蓣丸与顺铂联合运用，通过研究薯蓣丸对代谢相关基因HIF-1α与p53的调控，以及线粒体损伤的影响，观察其对HCC的辅助治疗作用。

1 材料与方法

1.1  主要试剂

胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司，货号：T1320）;高糖DMEM培养基（美国Hyclone公司，货号：AE29005267）;胎牛血清（美国Gibco公司，货号：2176404）;水合氯醛（货号：20180622）、无水乙醇（货号：GB/T678-2002）（上海国药集团化学试剂有限公司）;青霉素（货号：408G021）、链霉素（货号：70100900）（北京索莱宝科技有限公司）;环氧丙烷（上海迈瑞尔化学技术有限公司，货号：M25514）;锇酸（货号：18456）、DDSA（货号：18022）、NMA（货号：18032）、DMP30（货号：18042）（美国TED PELLA INC公司）;戊二醛（北京雷根生物技术有限公司，货号：DF0156）;HIF-1α小鼠抗人单克隆抗体（货号：ab1）、p53小鼠抗人单克隆抗体（英国Abcam公司，货号：ab26）;β-actin小鼠抗人单克隆抗体（美国proteintech公司，货号：66009-1-Ig）;HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体（美国proteintech公司，货号：SA00001-1）;RIPA裂解液（中国上海碧云天有限公司，货号：P0013B）;SuperECL Plus超敏发光液（美国Advansta公司，货号：K-12045-D50）;显影液（货号：BW-61）、定影液（货号：BW-62）（中国上海佳信公司）;TEMED（中国上海阿拉丁公司，货号：T105497）;SDS（货号：MB2479）、EDTA（中国大连美伦生物技术有限公司，货号：MB2514）;琼脂糖（西班牙BIOWEST公司，货号：111860）;mRNA逆转录试剂盒（货号：CW2569）、miRNA逆转录试剂盒（货号：CW2141）、上样缓冲液（货号：CW0610）、UltraSYBR Mixture（货号：CW2601）、DM2000 Plus DNA Marker（货号：CW0632）（中国北京康为世纪公司）;Tris（货号：V900483）、DEPC（美国Sigma公司，货号：D5758）;Trizol（美国Thermo公司，货号：15596026）;核酸染料（中国北京普利莱，货号：PB11141）。

1.2  药物

薯蓣丸使用中药配方颗粒，药物组成及生產批号：山药（0090443）24 g，当归（0103203） 6 g，桂枝（0116553） 6 g，建曲（0091033） 6 g，生地黄（0113523） 12 g，人参（0115203） 6 g，炙甘草（0112233） 12 g，川芎（0125883） 6 g，白芍（0121933） 6 g，白术（0111433） 6 g，麦冬（0121693） 6 g，苦杏仁（0112663） 6 g，柴胡（0110723） 6 g，桔梗（0101183） 3 g，茯苓（0110753） 6 g，阿胶（0112143） 6 g，干姜（0115493） 3 g，防风（0101983） 6 g，白蔹（0086073） 6 g，大枣（0111143）24 g，所有药物购自广东一方制药有限责任公司。将药物用温水溶解后，振荡制备成混悬液。根据薯蓣丸的药理学剂量规定，成人薯蓣丸日剂量为156 g/d，小鼠体质量约为20 g，根据人鼠体表面积换算，小鼠给药剂量为0.4 g/d。顺铂注射液（DDP）（齐鲁制药有限公司，货号9E0214B02）：5 mg/kg，每周1次，腹腔注射。

1.3  细胞与动物分组

采用HCC细胞株SMMC-7721，购自中南大学湘雅医学院细胞中心。BALB/c无胸腺裸鼠（雄性，5周龄），购自上海斯莱克实验动物有限公司（生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005），所有动物饲养在无特定病原体（specific pathogen free， SPF）级环境中，可自由地获取食物和水，并进行12 h/12h的明/暗循环。将1×107个SMMC-7721细胞接种于每只裸鼠右上肢后侧，建立人HCC裸鼠皮下移植瘤模型。实验从可触及裸鼠皮下移植瘤开始（肿瘤体积约为100 mm3），造模成功后，随机分为4组，每组6只，分别为：模型组（0.9%生理盐水0.2 mL/d）、薯蓣丸组（薯蓣丸0.4 g/d）、薯蓣丸+顺铂组（薯蓣丸0.4 g/d+每周腹腔注射顺铂5 mg/kg）、顺铂组（每周腹腔注射顺铂5 mg/kg）。每只裸鼠灌胃剂量为0.2 mL/d。

1.4  观察指标

1.4.1  肿瘤体积测定  每2天测量1次肿瘤体积，肿瘤体积計算公式为：（最大肿瘤长度×宽度2）/2[16]。连续干预14 d后，根据《实验动物：福利伦理审查指南》[17]对小鼠进行颈椎脱位安乐死，剥离皮下移植瘤并进行检测。所有实验动物均得到悉心照料，本实验通过中南大学实验动物福利伦理审查委员会批准。

1.4.2  透射电子显微镜成像  为了检测线粒体的超微结构变化，在用薯蓣丸或顺铂处理14 d后，收集人HCC裸鼠皮下移植瘤组织用于样品制备。实验步骤：（1）固定;取1 cm3组织块若干块，在4 ℃下用2.5%戊二醛在黑暗中进行12 h的初次固定，然后将组织在1%锇酸中固定1 h。（2）脱水：在分级乙醇系列（30%、50%、70%、80%、95%和100%）和环氧丙烷中进行脱水。（3）浸透：在环氧丙烷和环氧树脂中浸泡2 h，然后纯环氧树脂中浸泡3 h。（4）包埋：用纯环氧树脂包埋后入40 ℃烤箱烘烤12 h和60 ℃烤箱烘烤48 h。（5）切片：使用徕卡Ultracut UCT切片机以80 nm切片厚度用金刚石刀具切割超薄切片，将切片置于300目铜网上。（6）染色：电子染色（铅、铀染色）。（7）拍照：日立7700型透射电镜观察，用数码相机记录图像。

1.4.3  Western blot检测蛋白表达水平  采用Western blot方法检测人HCC裸鼠皮下移植瘤中HIF-1α与p53的蛋白表达。实验步骤：（1）蛋白提取：剪取25 mg组织，用冰预冷PBS洗涤组织，加入300 μL RIPA裂解液以裂解10 min;离心后将上清液转移入离心管。（2）制胶：在10%分离胶中加入TEMED后立即摇匀灌胶，异丙醇封胶。胶凝后倒去胶上层异丙醇并用滤纸将其吸干。在4.8%浓缩胶中加入TEMED后摇匀灌胶。将梳子插入玻璃板中，剩余空间灌满浓缩胶，等待胶凝固。（3）样品准备：在200 μL蛋白上清中加入50 μL 5×loading buffer混匀，沸水煮5 min，冰盒速冷备用。（4）电泳：据蛋白定量结果，第一孔点入marker 2 μL，其他每孔上样50 μg已变性蛋白。开始电泳，电泳恒定电压75 V，时间为130 min。待溴酚蓝电泳至胶底部，终止电泳。（5）转膜：分别切胶PD-1（50-55 kDa）、PD-L1（33 kDa）、CD4（55 kDa）、CD8（35 kDa）、 HIF-1α（120 kDa）、p53（53 kDa）、β-actin（42 kDa）。（6）封闭：用1×PBST配制5%脱脂奶粉，将膜浸入后室温静置60 min，在4 ℃下过夜后室温静置30 min。（7）一抗孵育：加入一抗Mouse anti-HIF-1α antibody（ab1），1∶200;Mouse anti-HIF-1α antibody（ab26），1∶500;Mouse anti-β-actin antibody（66009-1-Ig），1∶5 000，室温放置90 min。孵育结束后用1×PBST洗3次，每次15 min。（8）二抗孵育：加入二抗（HRP goatanti-mouse IgG， SA00001-1，1∶5 000;HRP goat anti-rabbit IgG， SA00001-2，1∶6 000），室温孵育90 min后，1×PBST洗3次，每次10 min。（9）ECL显色曝光：使用ECL化学发光液与膜孵育1 min，用滤纸吸尽液体，用塑封膜将膜包裹杂交膜，在暗盒内与X胶片曝光后显影冲洗。

1.4.4  RT-qPCR检测蛋白表达水平  采用RT-qPCR法检测人HCC裸鼠皮下移植瘤中HIF-1α与p53的mRNA表达。按照说明书使用TRIzol试剂从SMMC7721细胞中提取总RNA。然后以总mRNA为模板，用cDNA逆转录酶进行逆转录。定量PCR扩增程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，40个循环，熔解曲线分析：60～95 ℃。引物设计：在NCBI上搜索目的基因的序列，运用Primer 5软件设计引物，由上海生工合成引物。使用的引物如下：β-actin：F-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC和R-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC，基因产物223 bp;P53：F-CCCCTGTCATCTTTTGTCCCT和R-AGCTGGCAGAATAGCTTATTGAG，基因产物137 bp;HIF-1α：F-TCCAGCAGACCCAGTTACAGA和R-GCCACTGTATGCTGATGCCTT，F-GCACCCCAAGGCAAAAATCG，基因产物182 bp。

1.5  统计学分析

使用统计学软件SPSS 25.0分析数据，所有实验样本均重复3次，计量资料以“x±s”表示。用t检验进行两组间数据比较，多组比较采用单因素方差分析，多组间数据比较采用LSD方法检验判定统计学差异，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1  薯蓣丸对人HCC裸鼠皮下移植瘤生长的影响

体外肿瘤生长图显示，与模型组相比，薯蓣丸组、薯蓣丸联合顺铂组的瘤体皆有缩小。与模型组相比，薯蓣丸组、薯蓣丸联合顺铂组、顺铂组肿瘤体积缩小，差异具有统计学意义（P<0.05）;与薯蓣丸组或顺铂组相比，薯蓣丸联合顺铂组对肿瘤体积的抑制作用增强，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.2  薯蓣丸对HIF-1α、p53基因蛋白及mRNA表达的影响

HIF-1α基因的蛋白表达结果显示，与模型组相比，薯蓣丸组、顺铂组中癌基因HIF-1α的蛋白表达下降，差异具有统计学意义（P<0.05），且薯蓣丸联合顺铂组差异更加显著（P<0.01）。HIF-1α基因的mRNA荧光定量表达结果显示，与模型组相比，薯蓣丸组、薯蓣丸联合顺铂组、顺铂组中的HIF-1α的mRNA表达下降，差异具有统计学意义（P<0.01）;与薯蓣丸组相比，薯蓣丸联合顺铂组差异具有统计学意义（P<0.05）。p53基因的蛋白表达結果显示，与模型组相比，薯蓣丸组中p53的蛋白表达上调，差异具有统计学意义（P<0.05），且薯蓣丸联合顺铂组、顺铂组差异更加显著（P<0.01）;与薯蓣丸组和顺铂组相比，薯蓣丸联合顺铂组差异具有统计学意义（P<0.05）。p53基因的mRNA荧光定量表达结果显示，与模型组相比，薯蓣丸组、薯蓣丸联合顺铂组、顺铂组中p53的mRNA荧光定量表达上调，差异具有统计学意义（P<0.01）;与薯蓣丸组和顺铂组相比，薯蓣丸联合顺铂组差异具有统计学意义（P<0.01）。见图2。

2.3  线粒体结构观察

电镜下人HCC裸鼠皮下移植瘤中线粒体结构显示，模型组线粒体数量较少，线粒体变性，嵴状结构排列紊乱且大多已断裂，可见线粒体固缩，膜结构完整;薯蓣丸组线粒体数量多，线粒体嵴状结构部分损伤，但可见排列结构，部分线粒体固缩，膜结构完整;薯蓣丸联合顺铂组线粒体数量较多，线粒体嵴状结构排列整齐，结构清晰，线粒体未固缩，膜结构完整;顺铂组线粒体数量多，线粒体嵴状结构部分损伤，但可见排列结构，部分线粒体固缩，膜结构部分损伤。见图3。

3 讨论

中医认为肝癌的病机为本虚标实，本虚因长期癌毒内耗，加之手术、放化疗等损伤性治疗，易导致机体气血虚衰，脏腑功能衰退，全身代谢功能紊乱，免疫功能低下。治疗上，中医以“攻补兼施、扶正祛邪”为主要原则[18]。薯蓣丸治疗“虚劳诸不足，风气百疾”，根据脾为后天之本的思想，针对肝癌本虚标实的特点，可以将健脾扶正法作为肝癌辅助治疗的切入点[19]。现代研究[20-21]也表明，薯蓣丸及方内组分具有抗氧化、改善机体能量代谢、增强免疫、辅助抗肿瘤等多方面的作用。

缺氧是实体瘤的重要生物学特征，肿瘤微环境缺氧可诱导线粒体代谢从氧化磷酸化转变成糖酵解模式，这是肿瘤细胞线粒体代谢重编程的重要表现形式[22]。研究[8]显示，线粒体的损伤与含量减少是导致氧化磷酸化转向糖酵解模式的原因，而肝脏线粒体代谢异常是重要的致癌因素。肿瘤微环境的低氧可诱导线粒体酶的表达发生改变，导致线粒体代谢异常，其机制可能与 HIF-1α或p53基因的作用有关[23]。研究[24]显示，缺氧可通过过表达或稳定HIF-1来促进HCC进展和侵袭。HIF-1α的表达可降低线粒体的合成，从而导致细胞氧耗的减少[5]。研究[25-26]发现HIF-1α在HCC组织中高表达，通过不断激活与HCC生长相关的多种靶基因，参与HCC的微血管新生、能量代谢、增殖、侵袭转移、凋亡等过程，可促进HCC的发生发展，而抑制HIF-1α表达有利于控制HCC细胞侵袭和转移能力。另外，抑癌基因p53可活化PFK-2的亚型-TP53诱导糖酵解和凋亡调节因子（TIGAR），TIGAR降低了果糖-2，6-磷酸的表达水平，从而起到抑制糖酵解的作用[5]。但在肿瘤细胞中，p53基因常出现突变、表达下调或缺失，p53的失活可使代谢从氧化磷酸化转变到糖酵解模式[27-28]。因此，癌基因HIF-1α的活化与抑癌基因p53的失活，可诱导肿瘤微环境的缺氧，导致能量代谢从氧化磷酸化向糖酵解的转变，从而促进HCC的发生发展，其机制可能与线粒体的合成受损相关，靶向调控HIF-1α与p53有助于改善线粒体损伤，控制肿瘤的进展。

本实验研究结果表明，薯蓣丸具有抑制人HCC裸鼠皮下移植瘤生长的作用，而薯蓣丸与顺铂联合运用以后，其抑瘤作用更为显著。为了进一步明确其作用机制，本研究检测了人HCC裸鼠皮下移植瘤中HIF-1α与抑癌基因p53的表达，同时，在电镜下观察了各组皮下移植瘤中线粒体的结构。结果表明，薯蓣丸具有抑制缺氧诱导因子HIF-1α与活化抑癌基因p53表达的作用，同时改善了线粒体的结构破坏，薯蓣丸与顺铂两者联用具有协同作用。因此，猜测薯蓣丸可能通过促使HIF-1α失活与抑癌基因p53活化的作用，进一步保护线粒体结构，改善肿瘤微环境的能量代谢，从而发挥抗HCC的作用。此外，研究结果发现薯蓣丸与顺铂联用以后具有协同增效作用，有报道显示，缺氧微环境促进肿瘤对放化疗抵抗和耐药[17]。另一方面，研究[29]显示线粒体参与顺铂的耐药性，改善线粒体功能可增强顺铂对肿瘤化疗的敏感性。并且，调控HIF-1α与p53的表达，有助于控制肿瘤细胞的顺铂耐药[30]。因此，薯蓣丸可能通过调控HIF-1α与p53改善了肿瘤微环境的缺氧，并且通过改善线粒体的功能，增强了HCC细胞对顺铂的敏感性，从而发挥了协同增效的作用，这为我们今后进一步对HCC的化疗增敏作用研究提供启发。

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