酿酒酵母多物混合发酵对咖啡豆风味品质的影响

赵林芬，弘子姗，杨 凯，龚加顺，谭 超

(云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明 650201)

咖啡豆(coffee bean)是茜草科(Rubiaceae)咖啡属(Coffea)植物的种子[1]。作为一种古老的天然饮品，咖啡具有多种活性成分，烘焙后散发诱人的芳香[2-3]。云南是中国第一个种植咖啡的省份，也是目前我国最大的咖啡产地，主要种植小粒咖啡(CoffeaarabicaLinn.)。种植区主要分布在云南西南部的保山、临沧、普洱、版纳、怒江等地，那里大部分海拔超过1 000 m[4]。得天独厚的自然条件，海拔和纬度造就了云南咖啡酸味适中、浓而不苦、香味醇和、略带果味的特质[5]，但与瑰夏(Geisha)等精品咖啡相比，云南咖啡豆花果甜香风味不足。咖啡风味不仅受品种和种植环境的影响，采收后加工过程中发酵环节也起到至关重要的作用[6]。

国内外主要聚焦于咖啡风味成分分析及烘焙对风味的影响研究，针对咖啡发酵风味的研究相对不多。近年来，微生物发酵对咖啡风味品质形成的影响研究逐渐成为热点。佟世生等[7]对酶解偶联发酵处理的云南小粒咖啡鲜果和生豆进行电子舌分析，发现通过酶解偶联发酵咖啡鲜果可以得到与天然麝香猫咖啡风味相同的咖啡豆。Wang等[8]通过添加葡萄糖控制乳酸乳球菌亚种(Lactococcuslactissubsp.cremoris)发酵生咖啡豆，发现乳酸乳球菌亚种可显著提高咖啡的风味属性。魏敏等[9]研究了桑肠杆菌(EnterobactermoriL4-3，CCTCC M2012020)发酵对咖啡提取物挥发性成分的影响，发现发酵后咖啡提取物中带有咖啡特征香气的同时还带有浓郁坚果、奶香等丰富香气，刺激性成分、苦涩感减少。这些研究均是利用微生物在咖啡本身风味特质的基础上进行的改善研究，通过外添天然的风味物质利用微生物发酵过程改善咖啡风味品质的研究报道较少。

酿酒酵母又称面包酵母或出芽酵母，适宜生长温度为25～30 ℃，在低温条件下非酒精发酵时，会抗性生长，累积包括挥发性醇、酯、酚、酮、芳香族等丰富的香气成分[10]。本研究拟在云南咖啡鲜果中添加可能提供香料气味(肉桂、香草)、水果气味(苹果、甜橙、香蕉)、甜香气味(蜂蜜)的底物，利用酿酒酵母发酵混合物，对发酵后的咖啡生豆进行理化性质、香气成分分析，以及对烘焙后的咖啡风味进行主观评价。探索混合发酵对咖啡花果甜香风味的改善，为进一步改善云南咖啡花果甜香特质，提升咖啡风味提供一定理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

咖啡鲜果(CoffeaarabicaLinn.，2018年云南省普洱市苡榕庄园产)；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae，2018年安琪酵母股份有限公司产)；白砂糖，太古糖业(中国)有限公司；百花蜂蜜，云南农业大学东方蜜蜂研究所；苹果、甜橙、香蕉、肉桂、香草，市售；其他实验试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

EU-K1-20T型超纯水机，南京欧铠环境科技有限公司；TGC20M型离心机，湖南湘立科学仪器有限公司；KDN-04B型凯氏定氮仪，浙江托普仪器有限公司；SOX406型索氏抽提仪，济南阿尔瓦仪器有限公司；METTLER TOLEDO HS153型水分测定仪，上海锐析仪器设备有限公司；Brewista型200 mL专业咖啡杯测碗勺，苏州顺和丰家电科技有限公司；R500F型咖啡烘焙机，北京三豆客科技有限公司；SW-CJ-2D型超净工作台，苏州净化设备有限公司；FlavourSpec®型气相离子迁移色谱仪，济南海能仪器股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1咖啡鲜果的发酵

咖啡鲜果用超纯水清洗浸泡3 min后经121 ℃灭菌15 min。白砂糖、蜂蜜、苹果、甜橙、香蕉、肉桂、香草原料经紫外照射灭菌30 min。灭菌后的咖啡鲜果和风味底物放入超净工作台中备用。样品设置为A～F共6个组，3个平行，每种样品按m(咖啡鲜果)∶m(酿酒酵母)∶m(风味底物)=60 g∶3 g∶37 g配制，风味底物按每个样品质量分数配比，包括对照组A为水37%；香料组B为肉桂粉1.5%、香草粉1.5%、水34%；苹果组C为苹果18%、糖2.4%、水16.6%；甜橙组D为甜橙18%、糖2.4%、水16.6%；香蕉组E为香蕉18%、糖2.4%、水16.6%；蜂蜜组F为蜂蜜6%、水31%。配制好的样品装入灭菌后的蒸煮袋，并真空封装。于20 ℃恒温发酵24 h后隔袋手工揉捻让咖啡豆与果皮分离，再继续20 ℃恒温发酵24 h，取出分离咖啡豆于不锈钢托盘中40 ℃鼓风干燥至豆体水分质量分数为10%～12%。

1.3.2咖啡生豆的烘焙

根据中度烘焙豆在香气和口感上的相对优势，采用中度烘焙[11]。准确称取100 g咖啡豆，置于咖啡烘焙机中烘焙，入豆温度150 ℃，并以5 ℃/min升温，12 min后温度达到210 ℃后恒温烘焙，当咖啡豆烘焙时产生第一次爆破音后10 s迅速出豆冷却，烘焙咖啡豆艾格壮数值(Agtron number)为58±1，研磨粉艾格壮数值为63±1，装入带单向透气阀的袋子放置24 h。

1.3.3烘焙咖啡豆风味的感观评价方法

咖啡风味的主观评价，也称为咖啡杯测，是采用美国精品咖啡协会(Specialty Coffee Association of America,SCAA)所设立的标准，利用人的嗅、味、触觉来评价咖啡的品质。本研究参考SCAA评分标准[12]，每个样品5次重复。将烘焙后咖啡豆磨粉后过美标20目网筛，取过筛后的咖啡粉(11±0.25)g加入200 mL 93 ℃的超纯水静置3 min后开始评定。评定指标包括干/湿香气、风味、余韵、酸质、体脂感、一致性、平衡性、干净度、甜度等级、综合考虑10项，最终扣除瑕疵度分值，得到最终分数。杯测表从6分开始标注，一共分为4个级别，6分为“好”；7分为“非常好”；8分为“优秀”；9分为“超凡”。每个等级又分4个给分等级，给分单位是0.25分，4个等级共16个给分点。最终得分高于80分，即为精品级。

1.3.4混合发酵后咖啡生豆的理化性质测定

总灰分的测定按GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》方法；水分含量的测定采用METTLER TOLEDO HS153型快速水分测定仪；还原糖含量的测定按GB 5009.7—2016《食品安 全国家标准 食品中还原糖的测定》直接滴定法；多糖含量的测定采用蒽酮-硫酸比色法[13-14]；脂肪含量按GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中 脂肪的测定》索式抽提法；蛋白质含量的测定按GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白 质的测定》凯氏定氮法。可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G250染色法[15]；多酚含量参考GB/T 31740.2—2015《茶制品 第2部分：茶多酚》的方法。

1.3.5挥发性成分的测定

气相色谱条件：1 g样品于20 mL顶空进样瓶中，40 ℃平衡20 min，取顶空气体进样200 μL用GC-IMS进行测试，载气N2，进样针温度45 ℃，色谱柱FS-SE-54-CB-1(15 m×0.53 mm，1 μm)，柱温箱温度60 ℃，载气流速程序为0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～15 mL/min；10～20 min，20～80 mL/min；20～40 min，100～130 mL/min。离子迁移谱条件：漂移管长度98 mm；管内线性电压500 V/cm；漂移管温度45 ℃；漂移气N2；漂移气流速150 mL/min；离子源β-射线(氚)；离子化模式为正离子。

1.4 数据分析

采用Excel 2017进行数据整理，采用IBM SPSS 22进行数据差异性分析，采用Laboratory Analytical Viewer和GC×IMS Library Search Software分析样品中挥发性有机物的差异谱图，并结合NIST数据库和IMS数据库对物质初步定性。

2 结果与分析

2.1 混合发酵咖啡生豆理化性质分析

将发酵完毕的咖啡生豆样品A～F组进行理化分析，结果见表1。

表1 混合发酵后的咖啡生豆基本理化成分Tab.1 Basic chemical components of coffee beans after mixed fermentation g/100 g

对6组发酵完毕的咖啡生豆进行理化分析表明，添加不同风味底物的咖啡生豆B～F组中脂肪和灰分的含量与对照组A均无显著差异(P>0.05)，但咖啡生豆可溶性蛋白质含量比对照组A均显著增加(P<0.05)，增加的可溶性蛋白质可能来源于添加的风味底物，因为酿酒酵母利用碳水化合物进行生长代谢，合成可溶性蛋白质的能力较弱。香料组B的还原糖、总蛋白质、可溶性蛋白质含量是所有组中最高的，分别为(8.28±0.39)、(6.34±0.32)、(1.87±0.01)g/100 g，其中还原糖在苹果组C、甜橙组D中差异显著(P<0.05)，总蛋白质在甜橙组D、香蕉组E中差异显著(P<0.05)。有研究表明，发酵后的香草还原糖可达14.58%，肉桂中蛋白质质量分数约11.70%[16]，这可能是导致香料组B还原糖、总蛋白质最高的原因之一。苹果组C添加了2.4%蔗糖，发酵过程中糖会转化为酸类，同时苹果本身含有大量酸类物质，因此苹果组C的总酸含量在所有组中最高为(7.99±0.49)g/kg与香蕉组E差异显著(P<0.05)，但与其他组差异不明显。添加了蔗糖的苹果组C、甜橙组D、香蕉组E，还原糖的变化情况与对照组A相比参差不齐，排除一定程度上的统计误差，可认为外来糖源的添加会对咖啡豆还原糖含量造成一定影响，其中苹果组C、甜橙组D与对照组A相比还原糖含量显著下降(P<0.05)。利用蜂蜜无氧发酵后，蜂蜜品质会降低，酸度增加，总糖和蔗糖含量下降[17]。蜂蜜组F酸度、多糖、还原糖含量与对照组A相比有变化，但变化不明显(P>0.05)，多酚质量分数最高为(3.16±0.09)g/100 g与对照组A、苹果组C、甜橙组D差异显著(P<0.05)，将其烘焙后进行风味主观评价发现其酸味过重。

从理化分析结果来看，添加不同底物与咖啡发酵对咖啡豆中灰分和脂肪含量无影响(P>0.05)，但可显著提高可溶性蛋白质的含量(P<0.05)，而风味底物的添加对最终咖啡豆中多糖、还原糖、总蛋白质、多酚具有不同的影响，表现为有的增加有的减少，有些显著有些不显著，变化无明显规律，可能是受到添加风味底物本身的影响。

2.2 混合发酵咖啡生豆香气分析

利用GC-IMS对发酵后的咖啡生豆香气进行测试，在所有样品中共检出包括未知成分在内的53种化合物，结合GC-IMS自带谱库及NIST谱库共定性出36种共有化合物，分别为9种酯类、6种酮类、8种醛类、6种醇类、5种烯萜、1种呋喃、1种酸类以及检出17 个共有信号的未知成分(图1)。通过计算相对含量(图2)，所有咖啡生豆中酮、醛、醇、酯类共占检出香味物质的60%以上，这4大类成分含量和丰富度也较高。添加不同的底物进行发酵会导致咖啡生豆中酮、醛、醇类(除蜂蜜组F外)含量均下降，酯类、烯萜、呋喃(除香料组B外)含量上升。

图1 混合发酵后的咖啡生豆挥发性香气相对含量热图Fig.1 Heat map of relative contents of volatile aroma in coffee beans after mixed fermentation

图2 混合发酵咖啡生豆香气成分相对含量汇总Fig.2 Summary of relative contents of aroma components of coffee beans after mixed fermentation

在A～F组发酵后的咖啡生豆香气中，丙酮相对含量最高为12.6%～18.6%，在添加风味底物发酵后丙酮(辛辣、微甜、愉悦香气、带特征性芳香)、甲基异丁酮(香蕉、水果甜、愉悦香气)、2-丁酮含量均有不同程度下降，其他酮类化合物有增有减。

生豆醛类物质中以壬醛(果味、脂肪、玫瑰香)、己醛(果味、木质味、苹果味、草味、橙子味)、2-甲基丁醛(可可味、咖啡味、果味甜)为主各占4.25%～4.75%、3.55%～5.96%、1.51%～5.72%。在添加风味底物发酵后己醛、2-甲基丁醛、丁醛(发霉、杂味、发酵刺激味)、3-甲基丁醛(苹果味、脂肪、杏仁味)、戊醛均有不同程度下降，其他醛类化合物有增有减。

生豆醇类物质中以乙醇(愉悦的酒精味)、异丙醇(尖锐、不愉快的燃烧味)为主，各占6.02%～7.13%、2.73%～3.18%，在添加风味底物发酵后乙醇、正戊醇、正己醇均有不同程度下降，3-甲基-3-丁烯-1-醇(水果香、草本、木质、甜美)有不同程度上升，其他醇类化合物的相对含量有增有减。

生豆中酯类物质最为丰富，以乙酸乙酯(香蕉、苹果味、白葡萄、果香、甜美)、异戊酸乙酯(果味、酒味、甜味、发酵乳味)、乙酸丙酯(梨、覆盆子味、愉悦的苦甜)为主，各占2.81%～10.79%、1.05%～6.59%、1.52%～2.22%。在添加风味底物发酵后乙酸乙酯、异戊酸乙酯大幅度上升，丁酸乙酯不同程度上升，乙酸丁酯(果味、菠萝味)、乙酸丙酯、己酸乙酯(果味、菠萝味、香蕉味、烟味)下降，其他酯类化合物的相对含量有增有减。在酯类化合物中E组添加了香蕉的发酵咖啡酯类含量增加最为明显，这与香蕉本身所带有的酯类香气物质存在较大关系。大量增加的乙酸乙酯和异戊酸乙酯能为咖啡香气增加独特的果香，与此同时E组酮类中丙酮、醛类中己醛、庚醛(果味、不愉快的脂肪味)、丁醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛下降最明显，这在烘焙咖啡豆风味主观评价中也得以体现。

烯萜具有香料香味，月桂烯(甜美、香酯、玫瑰、芹菜、胡萝卜、薄荷、柑橘、热带水果味)、柠檬烯(甜橙、柑桔味)分别有类似肉桂和柠檬清淡的香气，生豆中烯萜类中香料组B添加了肉桂和香草的咖啡苯乙烯大幅度增加318.52%，甜橙组D添加了甜橙的咖啡柠檬烯大幅增加501.72%。香料组B、甜橙组D在最终烘焙后风味主观评价中也能够表现出相应桂皮、香草、橙香。

香料、水果与咖啡发酵可以使得香料、水果本身所带有的香气赋予咖啡，提升咖啡花果香特质，蜂蜜与咖啡发酵在香气方面未发现有突出特点，不同香料、水果对咖啡果香味提升有不同针对，因此如需特定提升某种花果香味尚需进行进一步的配比调和研究。

2.3 混合发酵后的烘焙咖啡豆风味感观评价结果

对混合发酵后的烘焙咖啡豆风味进行感观评价，得分见表2。香料组B和甜橙组D达到精品咖啡标准，得分超过80分，风味描述上可明显辨识出精品咖啡中所希望呈现出的桂皮、香草、甜橙等加分风味。B～E组评分均高于对照组A，说明添加香料及水果在低温厌氧条件下利用酿酒酵母发酵咖啡鲜果对最终的烘焙咖啡豆风味有一定提升。但蜂蜜组F酸度过高，风味主观评价分低于对照组A，主要与酿酒酵母利用蜂蜜中糖类发酵产酸有关。烘焙咖啡豆风味主观评价结果中所有样品均存在酸度偏高、风味单一、苦味突出且醇厚度低的问题。这与酿酒酵母发酵糖类产酸有关，苦味主要来源于咖啡中绿原酸和咖啡因的变化。在利用酿酒酵母发酵咖啡增香的同时，如何抑制咖啡酸苦味的增加需进一步研究。

表2 混合发酵后的烘焙咖啡豆风味感观评分Tab.2 Sensory score of flavor of roasted coffee beans after mixed fermentation

3 结 论

利用酿酒酵母在低温厌氧条件下添加天然风味底物与咖啡发酵，与无底物对照组相比发酵后的咖啡生豆中灰分和脂肪含量无影响(P>0.05)，可溶性蛋白质的含量显著提高(P<0.05)，而底物的添加对最终咖啡豆中多糖、还原糖、总蛋白质、多酚具有不同程度的影响，无明显规律。对发酵后的咖啡生豆进行GC-IMS香气分析，共定性出 36种共有化合物，9种酯、6种酮、8种醛、6种醇、5种烯萜、1种呋喃、1种酸类及17个共有未知信号成分。其中酮、醛、醇、酯类共占检出香味物质的60%以上。对发酵后烘焙咖啡豆风味进行主观评价，表明香料、水果与咖啡发酵可使其香气赋予咖啡，提升咖啡花果香特质，其中香料组、甜橙组风味主观评价达精品咖啡标准，香蕉组香气较为突出。蜂蜜组在香气方面未有突出特点，酸度较高、甜度不足。综合理化、香气成分和风味主观评价结果来看，添加天然风味底物并利用酿酒酵母在低温厌氧条件下发酵云南咖啡鲜果，能在一定程度上改善咖啡风味品质。