复合益生菌黑米饮料工艺研究

杨宇

（润盈生物工程（上海）有限公司，上海 201700）

黑米营养丰富，蛋白质、赖氨酸、脂肪含量分别为10%～13%、0.4%～0.6%、2%～5%，富含P、Ca、Se、Mo、Mn、Cu、Zn 和Fe 等矿物质元素及VB1、VB2、VB6、VB12、VE、VD 和 烟 酸 等 维 生 素，尤其富含普通米缺乏的胡萝卜素和VC[1]。黑米及黑米皮中花色苷是重要的生物活性物质具有很强的抗氧化和清除自由基的能力[2-4]，在偏酸性环境下随着溶液pH 降低，稳定性增加，溶液浓度对稳定性影响较小[5]。对黑米的研究和应用不断深入，与市场上受欢迎的乳酸菌饮料和益生菌产品结合可以研制营养保健、口感清爽、风味独特的活性乳酸菌饮料。

近年出现了许多关于植物乳杆菌等益生菌调节肠道菌群的产品和功能研究[6-10]，及以黑米为原料制作饮料的研究[11-12]。参考国际市场上的养乐多等活性乳酸菌饮料，结合生产实践中遇到的问题和需求，本文围绕发酵型黑米饮料的关键工艺和发酵过程进行试验及分析，通过正交试验确定活菌型黑米饮料的配方，以期为黑米和益生菌资源高效利用及其乳酸饮料的研发与生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑米、白砂糖，购于永辉超市；直投式发酵剂（植物乳杆菌Lp-G18、嗜酸乳杆菌Lp-G80）200 U/包，润盈生物工程（上海）有限公司；中温α-淀粉酶（酶活3 750 U/g），天野酶制剂（江苏）有限公司；复配增稠稳定剂（结冷胶、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、麦芽糊精），荷兰皇家帝斯曼集团；柠檬酸，潍坊英轩实业有限公司，乳酸，河南金丹乳酸科技有限公司；MRSA 培养基，北京陆桥技术股份有限公司；蒸馏水。

1.2 仪器与设备

FE20 型电子天平、BSA822 型pH 计、MYP19150型电动搅拌器、G20 型全自动滴定仪，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；博勒飞DV-II+Pro 数显粘度计，天津市布鲁克科技有限公司；FA25 型间歇式高剪切机，上海弗鲁克科技发展有限公司；LDZX-50KBS 型灭菌锅，上海申安医疗器械厂；HH-W600型数显恒温水浴锅，上海浦东物理光学仪器厂；APV-1000 型高压均质机，上海顺仪科技有限公司；CB 800V 型超净工作台，苏洁医疗器械（苏州）有限公司限公司）。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

复合益生菌黑米饮料的工艺流程为：黑米→蒸煮→打浆→高剪切→酶解→定容→均质→灭酶→冷却→接种→发酵→检测→加入灭菌的糖和稳定剂溶液→定容→调配→检验→均质→灌装→冷藏。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 确定黑米用量

对原料进行标准化，按黑米蛋白含量7.8%、脂肪含量1.6%、碳水化合物73.8%计算。本文均按质量计，配制蛋白质含量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的黑米浆，30 U/kg 淀粉酶65 ℃水解30 min，按工艺流程制成发酵黑米浓浆，检测发酵后感官和发酵液pH。

1.3.2.2 酶处理黑米浆

蛋白含量2.0%的米浆分别在60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃和80 ℃下，30 U/kg 淀粉酶水解黑米浆30 min，检测粘度、pH，确定最适温度；在该温度下分别添加20 U/kg、30 U/kg、40 U/kg、50 U/kg 和60 U/kg 的淀粉酶，检测粘度确定淀粉酶合适添加量。

1.3.2.3 发酵时间

接种直投发酵剂，（38±1）℃恒温发酵4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h 和28 h，确定最适发酵时间，检测活菌数并进行感官评价。

1.3.3 检测方法

1.3.3.1 活菌计数

按照GB 4789.35—2016，平板计数法进行活菌计数。

1.3.3.2 理化指标测定

使用pH 计测定pH，粘度的测定选用2 号转子，60 r/min，冷却至25 ℃检测1 min。

1.3.3.3 感官评价方法

邀请20 位品尝者，按照表1 对样品进行评分。

表1 黑米发酵样品的感官评分标准

1.3.4 正交试验及数据分析

4 因素3 水平正交试验，确定活菌饮料中米浆、白砂糖、复配增稠稳定剂用量和pH 值4 个因素的最优水平，使用Excel 2010 软件对数据进行统计分析并绘制图表。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 黑米浆浓度对发酵速度的影响

发酵过程中会产生乳酸，导致体系pH 降低，发酵越快，pH 降低越快，产酸越多pH 越低。如图1和表2 所示，米浆中蛋白质等营养物质对发酵过程中pH 下降有明显影响，蛋白质含量0.5%及以下时由于含有的氨基酸、肽和糖类等营养物质相对较少，发酵速度慢；当蛋白质含量达到2.5%时，浓稠米浆不利于菌种分散均匀和生长，发酵速度并没有优于2.0%，且米浆口感过于稠厚，颜色为黑紫色，优选蛋白含量2.0%的黑米浆用于发酵。

图1 蛋白质含量对发酵速度的影响

表2 蛋白质含量对酸度的影响

2.1.2 酶处理的温度和酶用量对发酵的影响

α-淀粉酶从淀粉（直链和支链）、糖原和环糊精分子的内部水解α-1,4 糖苷键，能显著降低淀粉食品的粘度，越过α-1,6 糖苷键继续催化淀粉水解，主要产物是α-葡萄糖、α-麦芽糖和很小的糊精分子[13-14]，为乳酸菌的生长和产酸提供碳源。固定酶处理时间为30 min，通过测定料液粘度和38 ℃、20 h发酵的pH，可知该型号中温α-淀粉酶对米浆中淀粉的最适合酶解温度为70 ℃，而且水解充分时发酵米浆的pH 更低，如图2 所示。

图2 温度对酶解效果的影响

酶解30 min 条件下，随酶用量增大，米浆粘度逐渐下降，但50 U/kg 以上时由于粘度过低，在杀菌后出现了分层和沉淀，所以用40 U/kg 淀粉酶适度水解米浆中的部分淀粉，如图3 所示。

图3 酶用量对酶解效果的影响

2.1.3 发酵温度对发酵结果的影响

植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的适宜生长温度在38 ℃左右[15-18]，设定（38±1）℃恒温发酵，发现8 ～16 h 发酵pH 下降最快，24 h 以后pH 几乎不再降低。活菌数在发酵开始0 ～4 h 处于延滞期，产生的有机酸很少，米浆没有酸感。4 ～16 h 乳酸菌处于对数生长期，快速生长后受有机酸抑制，这期间米浆的pH 下降速度较快。20 h 后进入乳酸菌生长的稳定期，pH 下降缓慢，结果如图4 所示。

图4 发酵时间对pH 和活菌数的影响

酸感和发酵风味会随时间延长而更加浓郁，24 h 发酵感官评分最高，随时间延长风味会更丰富，但酸感更加强烈，如图5 所示。综合以上，确定24 h为最佳发酵时间。

图5 发酵时间对感官评分的影响

2.2 正交试验结果与分析

以活菌型乳酸菌饮料为参考，通过L9（34）正交试验，试验设计及分析如表3 和表4 所示。结果表明，对饮料感官评分影响最大的是高酯果胶用量，其次是白砂糖，试验最佳组合为A2B3C2D2。经验证，30%发酵黑米浆与灭菌后的糖浆混合，饮料白砂糖含量11%，高酯果胶用量为0.40%，用柠檬酸等酸味剂调pH 至3.8 时饮料稳定性和口感都很受欢迎，4 ～6 ℃贮藏30 d，活菌数大于1.0×108CFU/mL。

表3 正交试验设计

表4 正交试验结果与分析

3 结论

黑米具有低蛋白质、高碳水化合物的特点，其中较高含量的淀粉使米浆非常黏稠，给实际生产加工带来不便。所以发酵型产品的关键点是将米浆中的淀粉部分分解[19]，便于富集米浆碳源和氮源，使直投式发酵剂能在低粘度米浆中分散并获得足够的营养物质。本文所选中温α-淀粉酶需在40 U/kg 浓度下，70 ℃左右水解蛋白质含量2.0%的黑米浆30 min，经过均质、灭酶、冷却至（38±1）℃，接种由植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌组成的发酵剂，恒温发酵24 h，至pH 3.7 ～3.8，形成发酵黑米浆。由于黑米中的花色苷在酸性条件下显红色，发酵过程中黑米浆逐渐由深紫色转为靓丽的紫红色，未酶解的淀粉糊化使体系有一定的粘度，没有明显的分层或析水现象。

通过4 因素3 水平正交试验，可确定饮料含发酵黑米浆30%、11%白砂糖、高酯果胶0.40%，用柠檬酸等酸味剂调pH 至3.8 时，口感清爽且酸甜适当，颜色靓丽，有淡淡的米香味和发酵特有的风味，感官上最受欢迎。该活菌黑米饮料在4 ～6 ℃贮藏30 d，活菌数大于1.0×108CFU/mL。