“补肺益肾、养血祛瘀”法干预支气管哮喘小鼠气道炎症及气道重塑的作用机制*

王盛隆 刘海鑫 董爱爱 白 丽 陈慧婷 刘 灵 张亚妮 范嘉琦

（1.山西省中西医结合医院，山西 太原 030013；2.山西中医药大学，山西 晋中 030619）

目前全球约有3.34亿支气管哮喘（简称哮喘）患者，预计2025年全球哮喘患者将增至4亿［1］。根据伤残调整寿命年，哮喘位于所有疾病第14位［2］。该病已成为全球造成巨大社会经济、医疗负担的疾病之一。因此，提高哮喘的诊治水平对改善哮喘的整体控制和预后以及降低医疗成本均有重要意义。

哮喘主要以慢性气道炎症及气道重塑为主要病理特征，反复发作使炎性细胞及某些结构细胞释放的炎症因子及趋化因子使细胞因子网络调控异常，导致“炎症-上皮细胞损伤-气道重塑”的恶性循环过程，而气道重塑是导致哮喘患者肺功能快速下降及固定性气流受限的主要原因。因此，哮喘的治疗不仅要缓解持续存在的气道炎症，更要预防气道重塑的发生。本研究意在探讨“补肺益肾、养血祛瘀”法干预支气管哮喘小鼠NLRP3、白细胞介素-1β（IL-1β）、POSTN、转化生长因子-β1（TGF-β1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达及BALF中白细胞总数、EO%及NEU%，阐明该法对哮喘气道炎症及气道重塑的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

BALB/C雌性小鼠40只，SPF级、6～8周龄、体质量18～22 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2020-0004。实验前小鼠适应性饲养1周。本研究经山西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准编号：2020DW012），符合伦理委员会相关动物研究指导原则。

1.2 实验药物

“补肺益肾、养血祛瘀”中药复方（熟地黄20 g，当归12 g，陈皮 10 g，清半夏9 g，茯苓 16 g，党参18 g，阿胶10 g，款冬花12 g，川芎8 g，炙甘草6 g），按每日成人口服生药量水煎浓缩为0.91 g/mL，由山西省中西医结合医院药剂科提供。醋酸地塞米松片（遂成药业股份有限公司，0.75 mg/片）。

1.3 试剂与仪器

Trizol（Invitrogen）、TIANScript RT KIT（天根生化科技有限公司）、Mouse IL-1β ELISA KIT及Mouse TGF-β1 ELISA KIT（博士德生物工程有限公司）、磷酸盐缓冲液（PBS，北京中杉金桥生物技术有限公司）、LPS（Sigma Corporation of America）及 OVA（Sigma Corporation of America）。生物分光光度计（Bio Photometer，Eppendorf）、荧光定量 PCR 仪（ABI7500，Applied Biosystems）、压缩型雾化吸入机（PARI BOY N 085，PARI GmbH）及光学显微镜（CX31，Olympus Corporation）。

1.4 模型制备

参考农光民等［3-4］造模方法并经改良：分别于实验第0、6、13天将小鼠用乙醚麻醉，迅速以10 μL移液枪吸取5 μL致敏液（50 mL PBS+1 mg LPS+1 g OVA）鼻腔内滴入致敏；于实验第21天开始将小鼠置于自制雾化箱中以1%OVA溶液雾化吸入连续激发14 d，每次60 min。空白组用等量0.9%氯化钠溶液致敏与激发。

1.5 分组及给药

将小鼠随机分为空白组、模型组、中药组、西药组及中西结合组5组，每组8只。每次激发前30 min开始给药。中药组给予“补肺益肾、养血祛瘀”中药复方水煎浓缩液，以18.2 g/kg灌胃；西药组给予醋酸地塞米松片药液0.4 mg/kg灌胃，中西结合组给予中西药物分别灌胃，剂量同中药组和西药组；模型组与空白组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃。各组连续给药14 d。

1.6 标本采集与检测

给药第14天激发1 h后从小鼠眼球取血，血液样本放入1.5 mL离心管中，室温凝固2 h，3 000 r/min离心10 min，收集血清至新的离心管；然后从小鼠颈部气管会厌软骨下方切一倒“T”型切口，将12G幼鼠灌胃针插入气管，并用手术线结扎固定，迅速打开小鼠胸腔，用手术缝合线迅速结扎右主支气管，同时暴露左肺，抽取BALF置于细胞固定液中；取右肺上中叶置于液氮中保存。

1.6.1 BALF中白细胞总数计数及嗜酸性粒细胞百分比（EO%）、中性粒细胞百分比（NEU%） 将装有BALF的细胞固定液充分混匀，用移液管将BALF滴入血球计数板中，在光学显微镜下计白细胞总数，红细胞、脱落的上皮细胞、纤毛、杂质均不得计入；将剩余BALF重悬浮，取100 μL BALF重悬液在玻片以上700 r/min离心2 min进行甩片，行瑞氏-吉姆萨染色，待干燥后中性树胶封片，依据细胞形态学特点，光学显微镜下计算EO%及NEU%。

1.6.2 ELISA法检测血清中TGF-β1、IL-1β的表达按试剂盒说明书进行操作。

1.6.3 RT-PCR法检测肺组织中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA的表达 用Trizol提取组织样本中总RNA，取5 μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性；用TIANScript RT KIT进行反转录，实验操作按产品说明书进行。PCR反应参数：变性为95℃10 s，退火为58℃30 s，延伸为72℃30 s各1次，进行40个循环，收集荧光信号，反应结束；用荧光定量PCR仪采用2-ΔΔCT法进行数据的相对定量分析。分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60～95℃进行溶解曲线分析。

表1 引物序列

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 各组小鼠BALF中白细胞计数及分类百分比比较

见表2。与空白组相比，模型组、中药组小鼠BALF中白细胞总数、EO%及NEU%明显升高（P＜0.05），西药组和中西结合组则白细胞总数无明显升高（P＞0.05），EO%及NEU%显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，中药组均明显下降（P＜0.05）；与中药组相比，西药组及中西结合组均显著下降（P＜0.05）；与西药组比较，中西结合组白细胞总数、EO%及NEU%明显下降（P＜0.05）。

表2 各组小鼠BALF中白细胞总数计数及分类百分比比较（±s）

表2 各组小鼠BALF中白细胞总数计数及分类百分比比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与中药组比较，▲P＜0.05；与西药组比较，△P＜0.05。下同。

组别空白组模型组中药组西药组中西结合组n 8 8 8 8 8白细胞总数（×104/mL）143.40±42.41 483.80±59.39*331.80±48.87*#201.80±82.26#▲123.80±34.21#▲△EO（%）0.64±0.13 11.10±1.49*8.01±1.19*#5.89±0.62*#▲3.68±0.43*#▲△NEU（%）1.48±0.32 37.50±5.59*20.05±1.62*#15.06±1.21*#▲10.95±1.14*#▲△

2.2 各组小鼠血清中TGF-β1、IL-1β表达水平比较

见表3。与空白组相比，模型组、中药组、西药组及中西结合组小鼠血清中TGF-β1、IL-1β的表达明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，中药组、西药组及中西结合组均显著下降（P＜0.05）；与中药组相比，西药组及中西结合组显著下降（P＜0.05）；与西药组比较，中西结合组显著下降（P＜0.05）。

表3 各组小鼠血清中TGF-β1、IL-1β表达水平比较（pg/mL，±s）

表3 各组小鼠血清中TGF-β1、IL-1β表达水平比较（pg/mL，±s）

组别空白组模型组中药组西药组中西结合组n 8 8 8 8 8 TGF-β1 204.10±11.55 967.85±39.96*629.69±26.76*#588.40±17.92*#▲357.91±43.73*#▲△IL-1β 209.41±9.37 511.89±25.66*404.82±15.60*#364.14±15.90*#▲303.69±13.13*#▲△

2.3 各组小鼠肺组织中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA相对表达比较

见表4。与空白组相比，模型组、中药组、西药组及中西结合组小鼠肺组织中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA的表达显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，中药组、西药组及中西结合组均显著下降（P＜0.05）；与中药组相比，西药组及中西结合组显著下降（P＜0.05）；与西药组比较，中西结合组显著下降（P＜0.05）。

表4 各组小鼠肺组织中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA相对表达水平比较（±s）

表4 各组小鼠肺组织中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA相对表达水平比较（±s）

组别空白组模型组中药组西药组中西结合组n 8 8 8 8 8 POSTN 0.74±0.56 6.95±0.82*3.75±0.51*#2.87±0.47*#▲2.02±0.44*#▲△NLRP3 0.99±0.30 10.63±1.15*6.04±0.82*#4.13±0.91*#▲2.47±0.56*#▲△MMP-9 0.92±0.16 9.95±0.61*6.72±0.65*#4.10±0.57*#▲2.25±0.41*#▲△MMP-2 0.83±0.19 9.03±0.24*5.95±0.56*#3.86±0.41*#▲1.93±0.47*#▲△

3 讨 论

支气管哮喘属于中医学“哮病”范畴。哮喘反复发作，损伤气道；且久病耗气伤津，痰浊胶固，壅塞肺络，气血不畅，痰瘀互结，这种“因虚致瘀、虚实夹杂”的病理特征使病情缠绵难愈，与哮喘气道易感性增加，黏膜肿胀、充血，炎性分泌物渗出，导致气道痉挛狭窄，缺血缺氧，黏膜瘀血水肿，破坏气道的结构及功能，支气管平滑肌增生，细胞外基质沉积，而致气道重塑的认识有相通之处。国医大师洪广祥提出“痰瘀伏肺为哮证夙根”。张士卿则主张哮喘治疗中扶正固本与痰瘀同治是长期控制哮喘的关键。清·沈金鳌《杂病源流犀烛》于治肺病之法提出“血生脾，统于心，藏于肝，宣布于肺，根于肾”，即肺肾两脏主血也可病血的观点。盖以唯有血液充盈敷濡于肺，肃杀金性始得阴配而治节之令自调。一旦血虚失养，则既可乏阴津之源，又可涩肺宇之脉，也可血不养金而肺失濡润或瘀血留客，乃至宣肃违和失节而哮喘以生。由此可见，久病多虚多瘀，课题组提出“脏虚血弱、痰瘀互结”为哮喘反复发作核心病机，治疗总以“补肺益肾、养血祛瘀”为主。本研究方药由“金水六君煎”化裁而来。熟地黄甘温填精补血、培补下元而定喘。当归养血和血，理血中气，合地黄补阴以配阳，使血和气降；然“当归补血而主动”，谓其活血化瘀之效，配以阿胶养血滋阴、化痰清肺；川芎活血行气，化痰、瘀之窠臼，解阿胶之黏腻；党参补肺益气健脾，配甘淡渗湿之茯苓更能发挥补气健脾之功，可“培土生金”；清半夏燥湿化痰、消痞散结。痰之结由于气机不运，陈皮芳香醒脾，疏利气机，使脾阳运而湿痰去，气机畅而凝滞除；款冬花润肺下气、化痰止咳；炙甘草和中健脾，调和诸药。研究表明，“补肺益肾、养血祛瘀”类中药可以通过调节TNF-α、IL-1β等炎性介质阻断NF-κB信号转导通路［5］。药理学研究表明，补肺益肾药不仅具有抗炎、化痰、解痉平喘作用，同时能提高细胞免疫功能，增强机体抗邪能力［6］；养血活血类中药可以减轻哮喘气道炎性浸润，降低TGF-β1及MMP-9的表达［7］。

现代研究发现，支气管哮喘是由多种细胞（嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等）及细胞组分参与，多种炎性因子、炎症通路参与其发生发展的过程。在哮喘的发病过程中以Th2为主的免疫反应占主导地位，POSTN是一种细胞外基质蛋白，可以与整合素-αVβ1、αVβ3、αVβ5、α6β4和 αMβ2结合激活信号通路，而POSTN已被证实在哮喘患者中高表达［8］。当变应原侵入宿主触发2型免疫应答，Th2细胞因子IL-13刺激成纤维细胞产生、诱导POSTN高表达［9］，POSTN通过与受体相互作用，激活NF-κB/TGF-β，增加嗜酸性粒细胞的募集，诱导炎性因子产生，加速气道炎症的发生；与此同时，信号通路激活后，通过MMP-2和MMP-9增强了活化的TGF-β的水平并调节胶原蛋白合成及其弹性，进而促进细胞外基质蛋白沉积和气道重塑［10］。本研究发现，“补肺益肾、养血祛瘀”中药不仅可以降低哮喘小鼠肺组织中POSTN、MMP-9及MMP-2 mRNA的表达，同时可以降低哮喘小鼠血清中TGF-β1的表达，减少BALF中EO%，提示该法可能通过阻断NF-κB/TGF-β通路而发挥作用。

与此同时，基于哮喘细胞表型研究，人群归因危险度分析显示多达50%以上的哮喘患者为非嗜酸性粒细胞哮喘，其中以中性粒细胞型哮喘最为多见［11］。NLRP3炎症小体是目前研究较多的炎症小体，由胞内固有免疫受体NLRP3、接头蛋白ASC和蛋白酶Caspase-1作为核心组成的多蛋白复合物，是气道中表现出来的最佳特征性亚型，在慢性疾病（如哮喘）的发生发展中起着重要的作用［12-14］。当各种病原微生物、过敏原及损伤因素一旦激活NLRP3炎症小体，ASC作为“桥接蛋白”将活化后的NLRP3与Caspase-1相结合使其活化。活化后的Caspase-1将pro-IL-1β裂解、分化，成为成熟的IL-1β。IL-1β可促进Th17细胞分化、维持Th17相关细胞因子的产生，也可促进嗜酸性粒细胞的产生［15］。Th17及其相关细胞因子能够对中性粒细胞进行募集、活化并抑制其凋亡［16］，被认为是中性粒细胞哮喘发病的重要机制之一。本研究结果表明，“补肺益肾、养血祛瘀”法不仅可以减少哮喘小鼠肺组织中NLRP3的表达，同时可以减少哮喘小鼠BALF中白细胞总数、NEU%、EO%及血清中IL-1β的表达，提示该法在干预哮喘发病的混杂因素中发挥着一定的作用。

气道炎症及气道重塑是支气管哮喘治疗中永恒不变的话题。从机制来看，本研究结果显示，“补肺益肾、养血祛瘀”法能够减少哮喘BALF中白细胞总数，抑制EO%、NEU%和血清中TGF-β1、IL-1β的表达及肺组织中POSTN、NLRP3、MMP-9、MMP-2 mRNA的表达，由此提示，“补肺益肾、养血祛瘀”法可能通过抑制哮喘炎症因子释放、炎症细胞募集及细胞外基质蛋白沉积，从而减轻哮喘气道炎症及气道重塑；从疗效来看，中西结合疗效更为显著。