脑缺血动物模型的制备及评估进展

胡志斌,黄 缨,丁玉强

(1.复旦大学实验动物科学部,上海200032;2.复旦大学脑科学研究院,上海200032)

脑缺血（cerebral ischemic）是指脑内血流不足以满足大脑正常代谢需求的病理生理状态。脑内血流量突然减少或脑内代谢速率迅速增加均可导致脑缺血。脑缺血常常会造成不同程度的脑损伤，因此被认为与神经退行性疾病相关［1-2］。根据病因，脑缺血可分为血栓型、栓塞型和低灌注型［3］；根据缺血区域，脑缺血可分为局灶性缺血和全脑性缺血［4］。临床上，脑缺血性疾病约占所有脑血管疾病的80%［5］。现有的流行病学调查结果显示，近年来我国居民脑卒中患病率约为2%［6］。《中国居民营养与慢性病状况报告（2015年）》也显示，我国脑卒中患者死亡率约占总死亡率的22%，其中缺血性脑卒中的发病率约占全部脑卒中的69.6%［7］。因此，针对脑缺血性疾病的研究非常重要。

为了更好地理解脑缺血的发病机制以及寻找有效治疗方法，多种脑缺血动物模型被开发，并成为研究不同脑缺血性疾病的重要在体研究手段。有关脑卒中流行趋势和相关动物模型的制作方法、影像学特点等在国内外已有很多文献发表［8-10］。本文重点介绍不同动物类型的脑缺血模型研究进展，以及全脑、局灶性相关脑缺血动物模型的种类、制备方法、特点及应用范围，并对造模动物的感觉运动行为学及组织学评估实验进行概述，以期为脑缺血动物模型的选择和应用提供参考。

1 脑缺血模型实验动物的选择

目前，已有多种实验动物被应用于制备脑缺血模型，包括啮齿类动物、非人灵长类动物、兔、猪等。

啮齿类动物中，小鼠由于个体小、繁殖快、成本低、方便进行基因修饰等优势，在生物医药领域多个方面的研究中应用最广泛，其中也包括用于评估脑缺血的分子机制研究［11-13］。有研究者对不同遗传背景小鼠品系的双颈总动脉闭塞模型进行系统性比较研究，结果提示在最常用的7个遗传背景小鼠中，C57BL/6品系造模小鼠可出现典型的缺血症状，以及严重的皮层微灌注减少，而且不同个体之间组织学损伤重复性最高［14］。

大鼠的脑皮层和基底神经节血管系统及其生理学特点与人类非常类似。相对于小鼠及其他动物，大鼠体型大小适中，更便于监测生理参数及进行其他观察，也容易进行重复性研究。因此，大鼠是脑缺血研究中最常用的动物之一［15-16］。然而，不同品种品系大鼠在脑缺血造模时也存在一定差异［10］。2013年的大鼠脑缺血建模相关荟萃分析结果显示，使用相同品系大鼠构建的脑缺血模型具有相对同质性，其中Wistar大鼠的脑部梗死灶面积变异度最低［17］。

此外，蒙古沙鼠（长爪沙鼠）由于缺乏颈动脉与椎-基底动脉循环之间的联系，阻断其颈总动脉很容易造成其脑缺血，所以很早就被用来制备脑缺血模型并进行脑缺血相关机制的研究［18］。

非人灵长类动物作为与人类亲缘关系最近的一类动物，其脑部结构与人类非常相似，是进行脑缺血研究最理想的模型实验动物［19-21］。例如，很多神经递质保护药物的临床研究失败，主要原因之一是由于啮齿类动物的白质体积很小，从啮齿类动物模型研究中获得的实验数据与临床患者中的实际情况有很大区别［22］。而非人灵长类动物的脑组织中白质体积大，研究结果提示其慢性低灌注模型可以很好地模拟临床患者出现的神经胶质细胞激活及白质变化，比如纤维胶质酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）阳性星形胶质细胞数量增加，或是皮层炎性因子表达水平增加，或是神经元轴突髓鞘异常等［23-24］。

然而，非人灵长类动物的饲养成本高，且存在较多伦理争议，难以在多种条件下进行相关研究。为了克服这些局限性，研究人员也常利用多种其他动物（包括兔、羊、猪等）来制备脑缺血性疾病模型，从而进行诊断及治疗方面的临床前研究［25-26］。例如，有研究者通过观察脑缺血兔模型的脊髓运动神经元电生理性质，发现脊髓运动神经元可能与脑瘫痪时出现的肌肉僵硬有很大关联［25］。

2 全脑缺血动物模型

全脑缺血是指脑内全部或大部分血管中血流量降低，可分为完全性缺血和不完全性缺血。目前，常用的全脑缺血模型有双血管闭塞/低压模型、四血管闭塞模型和三血管闭塞模型。

2.1 双血管闭塞/低压模型

Eklöf等［27］首次制备了双血管闭塞/低压模型（图1A），在阻断大鼠双侧颈总动脉的同时，通过放血或使用降压药物降低大鼠血压；待血压降低至约50 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）时，通过控制双侧颈总动脉处止血夹的开闭，实现生理水平上具有显著变化的脑缺血和再灌注。之后，Sanderson等［28］对该模型进行了改进，他们首先从大鼠动脉抽出7～9 mL血液，再用止血夹闭塞颈动脉，8 min后通过输血或抽血将平均动脉压控制在30 mmHg左右，以此诱导全脑缺血，然后取下止血夹、回输血液，可实现再灌注过程；该模型降低了实验动物的死亡率。

双血管闭塞/低压模型具有操作简单、便于控制再灌注和检测生理变化等优点，然而闭塞过程会使得大鼠全身血流量降低，继而损伤心脏等其他重要器官。目前，该模型主要被应用于缺血性脑疾病的发病机制研究和抗脑缺血药物的药效观察［29］。

2.2 四血管闭塞模型

Pulsinelli等［30］最早制备出四血管闭塞模型（图1B），即在大鼠颈部腹侧正中切口，分离双侧颈总动脉并放置止血扣；在大鼠枕骨后方切口，暴露第一颈椎左右横突孔，将电灼针头插入两横突孔，永久性闭塞双侧椎动脉；通过控制止血扣的开闭，在清醒的大鼠中实现脑缺血和再灌注。由于难以验证第一颈椎左右横突孔中椎动脉闭塞是否完全，因此Sugio等［31］尝试通过在第二颈椎左右横突孔进行电灼以阻断双侧椎动脉，发现实验结果可视化增强，提高了实验的成功率。接着，研究者又对该建模方法做了一些优化。例如，范圣登等［32］用双极电凝器凝固横突孔表面的结缔组织，并用钢丝插入横突孔间接电灼以闭塞椎动脉，从而减少椎动脉出血；李兵等［33］用微型磨钻扩大第一颈椎横突孔，充分暴露椎动脉后将其闭塞，增强了建模的可操作性。

四血管闭塞模型因具有缺血完全的优点，能够较好地模拟临床上因休克、低血压而造成的脑缺血损伤过程，但其手术操作相对复杂，术中完全闭塞椎动脉对脑内血流量影响较大，使得再灌注不完全。目前，该模型主要被应用于脑缺血后认知功能方面的研究，以及抗脑缺血药物的药效评价［34］。

2.3 三血管闭塞模型

Kameyama等［35］最先制备出三血管闭塞模型（图1C），即通过在大鼠颈前区切口，分离胸骨舌骨肌和肩胛舌骨肌后，暴露出枕骨并开骨窗，通过骨窗从周围组织中分离出基底动脉，经电灼将其永久性闭塞；在确保大鼠神经功能未损伤的情况下，通过控制双侧颈总动脉处止血夹的开闭，实现全脑缺血和再灌注过程。随后，Panahian等［36］用特制的微型止血夹代替电灼，阻断大鼠基底动脉；该模型在不损伤基底动脉的情况下，重现性较好，但因手术难度较大而应用范围有限。Thal等［37］用细双极钳切断小鼠基底动脉，并在10 d后对存活的小鼠进行10 min短暂的双侧颈总动脉闭塞；该模型技术上可行，重现性好。

三血管闭塞模型具有重现性好、成功率高、对其他脏器损伤小等优点，然而手术难度较大，操作不当易致死。目前，该模型主要被应用于研究脑缺血过程中神经元的损伤机制［19，36］。

除了上述3种常用模型外，还有大鼠颈动脉分流模型［38］，但由于手术操作难度较大、成功率低而应用受限。此外，在灵长类动物和其他大型动物（例如兔、狒狒、猕猴等）中也有相应的模型［19］，但因饲养成本较高或与人脑构造存在差异等问题，尚未成为主流模型。

3 局灶性缺血模型

局灶性缺血是指在脑内特定区域血流量降低，是人类脑缺血性疾病发作的常见类型。迄今为止，人们对局灶性脑缺血模型的研究较多，也更为深入。缺血性脑卒中主要影响大脑中动脉的正常生理功能，因此现有脑卒中动物模型主要针对该血管的阻断进行研究。目前，常用的模型有开颅闭塞模型、线栓闭塞模型、血栓栓塞模型、光化学诱导模型、FeCl3诱导模型和内皮素-1诱导模型。

3.1 开颅闭塞模型

Tamura等［39］最早建立开颅闭塞模型（图2A），通过分离大鼠颞肌后用牙钻进行颞下颅骨切除，再通过电凝切断大脑中动脉近端，实现大脑中动脉的永久性闭塞，造成局灶性脑缺血，缺血性损伤常发生在大脑皮质区域。Bederson等［40］在暴露大鼠左侧中动脉后，用微双极电凝在不同部位进行闭塞，发现闭塞效果及大鼠神经功能的变化程度与闭塞部位有关，在近端闭塞大脑中动脉会造成更严重的皮质及皮质下区损伤。近年来，又有一系列研究对该模型进行了改进，例如在暴露大脑中动脉后可通过动脉压迫、动脉瘤夹或线圈将其闭塞，以实现短暂的局灶性脑缺血［41］。

开颅闭塞模型具有重现性好、易于控制血管闭塞位置及程度、与人的脑梗死病理改变相近等特点，然而手术难度较大，易造成颅腔感染，不利于实现再灌注过程。目前，该模型主要被用于研究不可逆性脑缺血的病理机制及抗脑缺血药物的药效［42］。

3.2 线栓闭塞模型

线栓闭塞模型具有重现性好、不需要开颅、易于控制缺血和再灌注过程时间等优点，然而手术操作难度较大、过程不能可视化，易造成蛛网膜下腔出血。该模型目前主要被用于研究可逆性脑缺血的病理机制，也有被用来评估不同品系动物之间脑缺血程度的差异［47-48］。

3.3 血栓栓塞模型

Kudo等［49］最先制备出血栓栓塞模型（图2C），即通过心脏穿刺取血，体外凝结形成血凝块，随后暴露大鼠左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，用微血管夹和细线分别暂时性闭塞颈外动脉起始部位和颈总动脉近分叉部位，将血凝块与生理盐水（即0.9%NaCl溶液）混匀后注射入颈总动脉内，之后解除闭塞恢复血流，从而制备血栓引起的局灶性脑缺血模型。然而，该实验中血凝块大小不一，难以确定其最终流向和闭塞部位。为了解决这一问题，DiNapoli等［50］通过微导管直接将血凝块注入大鼠大脑中动脉起始部位，同时使用激光多普勒血流仪检测血流变化，从而提高了血栓放置的准确性和实验结果的可重复性。Orset等［51］在收缩小鼠右侧颞肌并开颅暴露其中动脉后，通过注射凝血酶产生局部纤维蛋白凝块，形成原位血栓，20 min后再经尾静脉注射组织型纤溶酶原激活物以溶栓，实现脑缺血和再灌注过程。Chen等［52］在避免开颅和穿透硬脑膜的情况下，通过导管将血凝块和凝血酶经右侧颈外动脉精确输送至大脑中动脉处，形成稳定的血栓。

血栓栓塞模型具有与人类脑血栓病理机制相近的特点，但是存在难以控制血凝块的稳定性的问题，并且血流较大时血凝块易被冲散，从而造成其他侧支血管堵塞。该模型目前主要被用于溶栓干预和溶栓药物的研究［15，53］。

3.4 光化学诱导模型

孟加拉玫瑰红是一种Ⅱ型光敏剂，光激活后可直接将能量转移至氧分子，并产生大量的活性氧，从而与生物体内其他分子相互作用，进而造成机体损伤［54］。Watson等［55］最早使用孟加拉玫瑰红制备局灶性脑缺血模型（图2D），即通过尾静脉注射含孟加拉玫瑰红的生理盐水溶液，再暴露出大鼠的头骨，随后用波长为560 nm的光束照射其左侧顶盖骨，诱导血栓形成，从而造成局部梗死，实现缺血过程。Ikeda等［20］使用该方法对灵长类动物进行造模，即在麻醉普通狨猴后，静脉注射孟加拉玫瑰红，然后暴露其头骨，以左侧大脑皮层感觉运动区为靶点进行绿光照射，造成局部脑缺血，并通过相关行为实验评估普通狨猴生理功能的恢复情况。光化学诱导法也可用于建立因缺血而导致的脊髓损伤模型［56］。

图2 局灶性缺血动物模型制备示意图Figure2 Diagrams of craniotomy and mechanical occlusion(A),filament occlusion(B),thrombus occlusion(C),photothrombosis-induced occlusion(D),FeCl3-induced occlusion(E),and endothelin-1-induced occlusion(F)in global cerebral ischemia in laboratory animals

光化学诱导法具有避免开颅、重现性好、操作简单等优点，然而由于光照仅在皮质表面，血栓只在动脉末梢和毛细血管中产生，这与临床上血栓的影响范围差别较大。因此，也有研究结合脑部埋管技术，将光纤送入脑中特定的部位（例如纹状体），实现定点造模，并对该特定范围的脑部血栓进行针对性研究［57］。此外，使用不同波长的光源进行光化学诱导造模，效果也可能会有很大不同。例如，有研究结果显示，同样条件下473 nm较565 nm和593 nm波长，能引起更大面积的梗死灶［58］。目前，该模型主要被用于评估溶栓药物的药效，以及研究具有保护神经元作用的分子及其机制［21］。

3.5 FeCl3诱导模型

FeCl3是一种电解质，将血管暴露于其中，可通过产生活性氧的机制触发血管内壁损伤和内皮剥离，从而激活血小板，产生组织因子，诱发凝血级联反应，促使血管内形成血栓［59］。Karatas等［13］最早使用FeCl3闭塞大脑中动脉（图2E），即通过手术暴露小鼠头骨，在不损伤硬脑膜的基础上，用高速钻头在颧弓和鳞骨交界处开一骨窗，然后将浸泡于10%FeCl3溶液中的滤纸条经骨窗，紧贴硬脑膜，放置于小鼠大脑中动脉远端，3 min即可诱导血栓形成且不损害动脉周围皮质，10 min内可使得局部脑血流量迅速下降，17 min左右可实现大脑中动脉的完全闭塞。尽管这一模型能够形成稳定的血栓，但缺少动物脑缺血后功能的深入评价。为此，Syeara等［60］将20%FeCl3的滤纸条经顶骨上的骨窗闭塞小鼠大脑中动脉4 min后，移除滤纸条并擦干，随后用骨蜡封闭骨窗，并对小鼠进行14 d的运动功能测试；结果发现，小鼠只有轻微的一过性运动障碍，提示该模型可能不适于以运动功能为主要结果指标的实验研究。此外，FeCl3也可用于诱导颈动脉和肠系膜上静脉、动脉血栓的形成［61］。

社会主义发展新时期，我国城市化建设进程日益加速，建筑工程不断增多，由此引发的能源消耗问题越发突出，甚至部分地区已然接近城市所能提供的能源极限。在这样的时代背景下，建筑节能设计势在必行，是促进社会、自然和谐发展的有效举措，并在改善人居环境方面发挥了巨大优势，越来越多地受到人们的关注和喜爱。在此过程中，建筑节能设计需从多个方面进行考量，在因地制宜的原则导向下，选择科学的践行措施。

FeCl3诱导模型具有死亡率低、创伤小、价格低廉、易于活体显微操作等优点，然而FeCl3浓度、动物遗传背景和其他环境变量等均易对该模型产生显著影响。目前，该模型主要被用于研究溶栓药物，以及评估神经保护药物的药效［13］。

3.6 内皮素-1诱导模型

内皮素-1是一种强效的内源性血管收缩肽，与内皮素受体结合后可通过G蛋白偶联受体介导的信号通路调节细胞收缩，从而在宏观上造成血管收缩，组织内局部注射内皮素-1可造成缺血性损伤［62］。Macrae等［63］首次建立内皮素-1诱导模型（图2F），即通过将内皮素-1注射到大鼠左侧大脑中动脉外膜附近，并用氢清除法测定纹状体血流量，发现内皮素-1可引起剂量依赖性的脑缺血损伤，造成明显且持久的血管收缩现象，随后伴有缓慢的自发性再灌注过程。Sharkey等［64］在此基础上，利用立体定位技术标准化注射部位，降低了该模型的可变性误差。由于猪脑具有与人脑解剖结果高度相似的特点，Zhang等［26］对丹麦家猪进行开颅，将内皮素-1注射入皮质区，并通过神经功能评价和磁共振成像扫描，成功制备出猪的局灶性脑缺血模型。

内皮素-1诱导模型具有操作简便、损伤小和针对性强等特点，然而难以控制自发性再灌注，使得闭塞时间有限，重复性较差。目前，该模型主要被用于研究药物等对脑缺血过程中神经的保护作用。例如，阿尔兹海默症是一种常见的年龄相关的神经变性疾病，主要病理改变是淀粉样蛋白在脑内沉积以及神经元丢失。一项利用内皮素-1造模的研究发现，损伤脑内血管可加速淀粉样蛋白的脑内沉积和神经元的丢失，而阿魏酸可通过防止血管损伤逆转上述病理过程，为阿尔兹海默症的治疗提供了新的思路［65］。

4 脑缺血动物模型相关行为学评估

脑的各部位存在功能差异，例如海马或杏仁核与记忆有很大关联，而前额叶皮层在包括情绪、决策和认知等协调性思维和行动中作用重要［66］。如同脑卒中患者，脑缺血模型动物也会在行为上出现神经损伤症状，特别是感觉运动方面的缺陷［16］。即使在同一损伤部位，脑缺血的范围大小或严重程度，也会导致出现不同的行为改变。通过观察多种相关行为学指标，可以有效评估脑缺血动物模型是否构建成功，以便对相关作用机制或治疗效果进行判断［66］。下文对脑缺血模型研究中几种很常用的感觉运动相关行为范式进行简要介绍。

4.1 转棒实验（rotarod test）

转棒实验最早由Dunham等于1957年建立，此后常被用来评估啮齿类动物在中枢神经系统疾病相关模型中的感觉运动协调能力和运动学习能力［66］。在此实验训练过程中，可以让受试动物先在静止的杆上熟悉设备，再在低速旋转的转棒上学习平衡。正式测试时，将受试动物放置在旋转杆上，旋转速度恒定或加速度稳定，然后记录动物下落潜伏期。

4.2 胶带去除实验（adhesive tape removal test）

胶带去除实验最早由Schallert等建立，用来评估实验大鼠和小鼠的躯体感觉和运动能力［67］。实验时，先在动物身体的不同部位（例如前肢、后肢或鼻子）两侧放置胶带条，然后通过测量动物感觉及除去此胶带条所需要的时间来评估动物的表现。此实验由于操作相对简单，并能很好地客观评估相关能力，因此被长期广泛运用于啮齿类脑缺血模型［11］。

4.3 改良神经症状评估（modified neurological severity score，mNSS）实验

此实验常被用来在动物脑缺血发生后的不同时间点，衡量神经功能损伤的程度。根据荟萃统计结果显示，mNSS是在细胞治疗相关脑卒中研究中使用最多的行为范式之一［66］。mNSS可以通过简单的观察，对动物的运动、反射和平衡能力进行综合测试。测试时，可以先把神经功能状态进行一个等级划分，然后根据所观察到的动物行为状况给动物进行评估打分。例如，整个状态被分为0～14分，行为表现一切正常时定为0分，然后将缺陷行为表现按不同情况划分为14种，每种缺陷表现代表1分，包括前肢不能弯曲、头部不能在30 s内向纵轴转动至少10°、向瘫痪侧盘旋、无法直线行走、耳廓反射消失、角膜反射消失、无法在横木上保持平衡等，其中最严重的缺陷在此例中累积表现值为14分［68］。

4.4 圆筒实验（cylinder test）

由于脑损伤动物会更倾向于用非损伤侧控制的肢体，因此利用圆筒实验可以评价中枢神经系统疾病模型啮齿类动物的运动不对称性，也可以用来评估化学物质对动物运动性能的疗效。例如，实验时将动物放在一个开放的、透明圆柱体容器内，然后将它靠着容器壁站立时的前肢活动记录下来。前肢活动可以包括损伤同侧肢体活动、损伤对侧肢体活动及两侧肢体同时活动。前肢接触容器壁得分，然后计算各自活动接触总数的百分比［69］。

4.5 网格爬行实验（grid walking test）

此实验也是一种脑损伤动物模型常用的行为范式，它可以用来对动物的肢体自主运动能力进行评估［66，70］。在实验中，动物被放在正常角度或倾斜角度放置的金属丝网上，然后计算动物在高架网格上移动时一定时间内的配对总步数（放置两个前肢），以及动物将损伤侧控制的前肢放错位置导致其穿过网格的足部障碍错误总数。无损伤动物的足部错误通常接近于零。

5 脑缺血动物模型相关组织学评估

脑缺血发生后，除了对个体行为表现进行评估，组织学水平上的变化观察也是评估建模损伤严重程度、衡量疗效、研究相关作用机制的重要指标之一。并且，这些组织学变化可以体现在多个方面，例如损伤面积、胶质细胞产生的数量或新生神经元发生的出现等。下面对建模损伤面积及一些特定细胞类型相关的组织学评估进行简要介绍。

5.1 损伤区域的测量

在脑缺血动物造模后，通常需要对脑部损伤部位及大小进行测量和评估。Nissl染色是最常用的手段之一。一般是用焦油紫（cresyl violet）染料对脑切片进行染色；在损伤急性期观察损伤范围时，通常用2，3，5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）进行染色［12，71］。

Nissl染色法是利用神经元中的尼氏小体嗜碱性的特点，染色后可以很好观察脑部的细胞学结构；但在缺血的早期阶段，此法无法很好地显示脑部损伤。

虽然早有研究显示TTC染色存在一定误差，不能完全正确地反映脑缺血后损伤严重的细胞数量或面积，但是此方法由于快速、直观且成本低而被较多使用。有研究观察显示，TTC染色在建模1 h后就能清晰标记出脑缺血损伤部位［71］。所以，TTC染色仍然是急性期最常用的脑缺血模型组织损伤范围测量的首选方法。无色的TTC溶液经过组织细胞线粒体中的脱氢酶作用，产生红色产物，即正常的脑组织呈现红色，而损伤或坏死的组织部位细胞中，由于无法发生类似酶促反应而呈现白色。TTC染色时可以先在体灌注TTC染液，再取脑组织切片后观察；也可先取脑组织，切片后再进行离体TTC染色观察。值得注意是，有研究显示这2种处理方法在一些观察点，例如脑缺血24 h后在体灌注TTC所能观察到的脑损伤体积显著大于离体TTC染色［71］。另外，脑缺血后的组织细胞会因为损伤呈现一定的动态变化。例如，有研究显示光化学诱导建模后2 d，脑皮层损伤面积可扩大至最大，然后逐渐缩小［9］。另有研究显示，利用类似的光化学诱导建模，脑部海马或杏仁核的损伤面积在诱导后第一天达到最大［72］。因此，在同一研究中的某些环节，即使都采用TTC染色法，其执行观察的时间及方法细节都要尽量保持一致，以减少实验误差。

5.2 相关胶质细胞及新生细胞发生的观察

胶质细胞（包括小胶质细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞）是神经系统的重要组成细胞，在正常脑中起着支撑结构、参与突触传递等功能，而在非健康脑中则与神经系统损伤或疾病发生等机制密切相关［73］。众多研究显示，脑组织缺血发生后，胶质细胞在受损组织周围的数量会显著升高，其数量或作用也会随时间的推移而出现改变［74］。因此，胶质细胞数量及功能的观察也是评估建模损伤严重程度、观察疗效及相关作用机制研究的重要组成部分。

静止的星形胶质细胞会在脑部缺血损伤发生后的一定时间（1～2 d）内转化为反应性星形胶质细胞，后者的增殖能力强，并在损伤区的胶质瘢痕中出现GFAP的高表达［75］。这些星形胶质细胞在其中的作用具有双面性，例如，在前期可以产生多种不良炎性因子及自由基等作用，对机体造成危害［76］；之后又因为能逐渐升高神经保护因子如转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）的表达，或出现对损伤细胞碎片有吞噬性等表现，而呈现一定的组织保护性［77］。

脑部缺血后，损伤区域的小胶质细胞很快被激活，然后快速增殖而数量大增［78］。在有些脑缺血模型动物中，缺血30 min就可以观察到脑中激活的小胶质细胞［78］。类似星形胶质细胞，这些激活的小胶质细胞在脑缺血损伤过程中也同样具有双面性，例如，其能在急性期分泌肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β等炎性因子，或刺激星形胶质细胞分泌IL-1α和TNFα等不良炎性细胞因子，进一步对脑部组织造成伤害；也能在一定阶段分泌神经营养因子等，以实现一定的保护及修复作用［73］。少突胶质细胞在中枢神经系统中形成髓鞘，中风会导致少突胶质细胞出现严重损伤。有研究结果显示，在大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型中，少突胶质细胞数量减少发生在损伤后的第5～21天，也就是发生在神经元损伤之后；但研究同时显示，它在机体自我修复过程中可能也有重要作用［79］。

由于脑缺血后最直接的不良结果是脑组织细胞的坏死及相应功能的减弱或丢失，过去的研究往往集中在探究如何减少损伤。以前的观点认为，与其他器官不同，成年脑中没有神经元新生，因此神经元缺失后无法补充。但近年大量研究表明，室管膜下层（sub-ventricular zone，SVZ）和海马颗粒细胞区（sub-granule zone，SGZ）存在新生神经元发生［80］。基于干细胞领域的研究进展，尤其是胶质细胞转分化的新发现，人们开始探索受损脑组织是否有神经元的新产生，新生的神经元功能是否良好，以及是否具有原来部位神经元的特性。已有很多研究显示，脑缺血损伤发生后，脑部存在新生神经元发生的情况［81］。例如，星形胶质细胞一直被认为是脑缺血损伤后新生神经元发生的主要潜在细胞来源［75］，结合新生神经元标志物DCX、增殖细胞标志物5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2'-deoxyuridine，BrdU），在光化学损伤模型小鼠纹状体损伤区可以观察到GFAP+/BrdU+细胞及DCX+/BrdU+细胞显著增多［12］。然而，在脑缺血区域的新生神经细胞是否是由原损伤部位产生，一直存在争议。因为有研究显示，在纹状体损伤的MCAO模型中，虽然BrdU+阳性细胞数量在损伤区显著增加，但这些新生神经元实际上是从SVZ迁移而来［82］。此外，对于损伤区域出现的新生神经元是否真正具有神经元的正常生理或功能特性，则要根据其具体对应的细胞类型来做相应的检测和验证。

6 总结与展望

随着科学技术的发展，目前已有越来越多的方法被应用于脑缺血动物模型的制备。现今已发展出许多成熟的脑缺血动物模型，每种模型都有其优点和局限性。这些模型主要用于研究脑缺血性疾病的发病机制、具有神经保护作用的分子机制，以及抗脑缺血性药物的研发等。

脑缺血动物模型的制备为人类脑缺血性疾病的研究带来了许多便利。研究人员可以选择合适的动物模型，并通过控制动物的生理状况和环境等变量，严格确定损伤部位，从而在最大程度上模拟临床上相应的脑缺血性疾病。然而，同种模型在不同品系动物的应用上也存在差异［48］，目前尚没有一个完整的评估体系以供选择和参考。此外，现有的全脑缺血模型均以机械闭塞血管为主，会对动物生理状况造成严重影响，与人类全脑缺血的发病机制相比差异较大，不适于康复研究。为此，可借鉴局灶性缺血模型中的给药方法来开创新型动物模型，以满足实际研究中的需要。

尽管局灶性缺血动物模型的发展相对更为成熟，但近年来的研究中仍以短暂性大脑中动脉闭塞建模为主，而这一模型只符合2.5%～11.3%的脑卒中患者［83］。为此，后续研究应突出永久性闭塞大脑中动脉的重要地位，为临床上治疗脑卒中提供更为精准的研究模型。上述模型中部分可在造模中直接观察到阻断血流或再灌注的发生，但很多情形下缺乏这样的证据。如果将一些造模不成功的动物纳入实验数据统计分析中，还会造成实验结果重复性低，甚至出现相互矛盾的研究报告。一个建议的方法是，采用血流监测设备在造模中动态观察血流的改变，尽量确保造模动物在同一实验条件下表现出类似的损伤范围和病理改变，并结合之后的行为学及组织学等评估，尽可能最大程度地保障在建模稳定的基础上，对疗效及相关作用机制进行客观正确的观测。

相信随着研究的不断深入，不同脑缺血动物模型的局限性会逐渐得以解决，符合不同类型脑缺血性疾病的动物模型也会日益完善，以促使基础研究成果更好地转化为临床应用。