非洲猪瘟病毒复制相关基因E165R启动子预测及其甲基化分析

张彦兵 张石磊 刘良波 谢全亮 孙延鸣*

（1石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832003）

非洲猪瘟（African Swine Fever,ASF）自从 2018年秋季传入我国，迅速在我国各地区猪场点状散发，给我国的养猪业造成了严重的损失。非洲猪瘟病毒感染猪体，会造成猪体皮肤发红、发绀，出现皮炎，强毒感染可导致猪多个脏器出血，例如，脾脏、肾脏等出血，对猪体造成严重的病理损伤。非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）感染的靶细胞主要是猪原代肺泡巨噬细胞、树突状细胞以及骨髓细胞等[1]。

ASFV作为一类DNA病毒，基因组大小为170～190 kb，两端为可变区域，中间为保守的核心区域；由于两端高度可变使得ASFV具有较多的基因型[2]。ASFV有多层外膜包裹着病毒核酸，因此该病毒具有较强的耐受性，对酸碱不敏感；在潮湿的条件下，ASFV在猪肉中存活数年之久[3]。ASFV的灭活疫苗不能提供免疫保护，基因缺失疫苗仍然具有一定的毒力，甚至可导致猪只死亡[4]。到目前为止，仍然没有安全有效的ASF疫苗用于猪群的免疫保护。目前，为了防控ASFV的传播，主要采取生物安全防控措施来遏制病毒。

一般DNA甲基化发生在基因序列的cg位点，cg位点又称CpG位点，其甲基化主要由DNA甲基化转移酶（DNMTs）调控，哺乳动物DNA甲基化转移酶主要包括DNMT3B、DNMT3A和DNMT1，基因启动子区域高甲基化抑制基因表达，启动子区域低甲基化则利于基因转录表达[5]。ASFV复制过程中完全借助宿主细胞进行自我复制，宿主细胞自身DNA甲基化修饰是否参与限制病毒基因复制的过程，从而抑制ASFV的复制，还不清楚。

本文首次预测分析ASFV的复制相关基因E165R的启动子及其甲基化，通过生物信息学分析E165R基因的启动子活性和转录因子，进一步利用生物信息学手段预测其启动子甲基化区域。从DNA甲基化角度，初步分析病毒基因E165R启动子特性及其DNA甲基化位点，为研究DNA甲基化调控ASFV的感染奠定初步基础。

1 材料和方法

研究中所用的主要软件：DNA star、MEGA 7、NCBI Blast、BDGP、Promoter 2.0 Prediction、AliBaba 2.1、Meth Primer、QUMA等。

1.1 启动子预测及进化树构建

据报道，ASFV的E165R基因与病毒的复制相关。为了分析其启动子序列，首先从National Center for Biotechnology Information（NCBI） 获得中国 ASFV毒株 （African swine fever virus isolate Pig/HLJ/2018） 全序列（基因登录号：MK333180.1）[6]，从序列中选取E165R的编码区，进一步截取其上游500 bp的序列，作为其启动子。在NCBI数据库中比对E165R的启动子并下载其他ASFV毒株的序列，利用MEGA7构建进化树。

1.2 启动子活性及转录起始位点预测

利用在线预测软件BDGP（Berkeley Drosophila Genome Project）（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）预测启动子活性，打开软件，输入所要预测的DNA序列，点击submit按钮，软件开始运行分析。

利用 Promoter 2.0 Prediction Server[7]软件 （http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）预测启动子活性区域，打开软件输入被预测的DNA序列。

1.3 启动子区域转录因子预测

打开在线软件AliBaba 2.1（http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html），在对话框中将要预测的DNA序列粘贴进去，选择中等条件的参数，点击START按钮运行程序。

1.4 甲基化区域预测及甲基化检测引物设计

利用在线软件Meth Primer（Meth Primer-Design Primers for Methylation PCRs）[8]预测可能的甲基化区域，进一步设计甲基化检测引物，打开浏览器，输入IP地址：http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/met hprimer.cgi，网址点开后会显示软件的操作界面，将被预测的DNA序列粘贴到对话框中，点击submit按钮，软件运行显示结果，会给出几组引物序列选项。

1.5 DNA甲基化序列分析

DNA甲基化数据分析quantification tool for methylation analysis[9]软件，打开浏览器并输入 IP：http://quma.cdb.riken.jp/按下Enter键打开软件，genomic对话框输入基因组DNA序列，第二和第三对话框输入，测序获得的重亚硫酸盐处理转化后的序列，具体见表1。

表1 重亚硫酸盐处理转化后的序列比对

2 结果

2.1 ASFV dUTPase（E165R）基因序列分析及其启动子区域预测

从NCBI数据库中，搜索ASFV的基因信息，选择下载 Pig/HLJ/2018（MK333180），发现此毒株的E165R基因ATG是从166 507位点开始的，本研究截取E165R上游500 bp左右作为其启动子（165 985～166 506）。

2.2 ASFV dUTPase（E165R）基因启动子同源进化分析

在NCBI下载35株ASFV的E165R基因启动子序列，ASFV毒株分离时间跨度为1978—2019年，利用MEGA 7软件中NJ-1000方法构建同源进化树；通过进化树可以看到，不同来源的ASFV分为2大群，中国新分离的毒株与俄罗斯远东地区分离的毒株同源关系很近，ASFV E165R基因启动子处于165 985～166 506之间，选择的E165R基因启动子非常保守，在2大群中间都较保守（图1）。在此基础上，进一步分析E165R基因的启动子活性及甲基化位点CpG才有实际意义，也能较为普遍地反映ASFV毒株的E165R基因启动子甲基化区域。

图1 E165R基因启动子同源进化树分析

2.3 ASFV dUTPase（E165R）基因启动子活性预测

软件运行完毕之后会输出预测结果，结果中score的值越高表示预测结果越可信，图2中score值在0.98～1.0之间，表明预测结果可信度较高，所预测的启动子活性可信。此外，启动子序列中每一个预测结果里字体变大的碱基，表示转录起始位点。

图2 BDGP软件预测结果显示

利用Promoter 2.0预测软件，预测启动子转录起始位点，打开软件输入被预测的DNA序列，单击submit选项运行软件。运行结束后会更新页面，显示出预测的结果。预测结果显示，在第200位附近有一个潜在的转录起始位点，score值为0.619（图3）；因此，预测在第200位点上下游区域为可能的启动子活性中心。为了更加直观地显示所预测的E165R基因启动子活性，在序列上将2种软件所预测的活性区域进行标注，同时标出基因的ORF区域（图4）。

图3 Promoter2.0预测结果显示界面

图4 ASFV E165R基因启动预测活性区域及其ORF区域

2.4 ASFV dUTPase（E165R）基因启动子转录因子预测

在预测E165R基因启动子的基础上，进一步利用在线软件AliBaba 2.1预测其转录因子，共预测到7个转录因子，分别是 c-Jun、c-Fos、GCN4、2个 Sp1、Oct-1和C/EBPalp（图5）。其中较为常见的有c-Jun、Sp1和C/EBPalp。转录因子的成功预测与启动子活性的成功预测是相一致的。在转录因子Sp1、Oct-1和C/EBPalp结合序列上均含有cg甲基化位点，cg位点已标出（图 5）。

图5 E165R（dUTPase）基因启动子转录因子预测及CG位点标注

2.5 ASFV dUTPase（E165R）基因启动子甲基化检测方法

利用meth primer软件设计并预测可能的甲基化区域，打开软件输入序列，勾选亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR,BSP）选项并点击提交，可以获得5对BSP的引物，软件根据引物CG含量、退火温度等综合后进行了排名，实际情况下首选F1和R1为目标引物，如图6。BSP引物上不能含有被测的CpG位点，这样可以保证甲基化和非甲基化的片段高效扩增，保证扩增片段的准确性。BSP扩增的片段要通过TA克隆连接克隆载体，进一步挑选克隆产物进行测序分析，每个处理组克隆数目不少于15个。

图6 BSP引物设计结果示意图

除了设计BSP引物，还可利用软件设计甲基化特异性的引物 PCR（Methylation-specific PCR,MSP），结果见图7。在同一区域有2条引物，但每条引物的3’UTR处至少包含一个CpG位点，M引物为XXXCG，则与之对应的U引物为XXXTG。MSP法可以根据甲基化或非甲基化引物扩增的条带，迅速确定基因片段是否存在甲基化。若MF扩增出条带，UF无条带则说明在这一区域存在甲基化；反过来，UF能扩增出条带，而MF不能扩增出条带，则表明此区域不存在甲基化。

图7 MSP引物设计结果示意图

3 讨论

ASFV编码150～200种蛋白，许多病毒蛋白与病毒的复制密切相关[10-12]。如，E165R是ASFV复制所需的关键蛋白[13]。在猪的基因甲基化研究中，发现大量的重复序列处于高甲基化水平[14]，而这些重复序列恰恰源于病毒基因。说明宿主一般通过高甲基化的形式来限制某些有害基因的表达。

宿主DNA甲基化修饰可能参与限制病毒基因的复制，例如乙型肝炎病毒基因中存在高甲基化与其病毒蛋白复制有关[15,16]。本文选择ASFV复制相关基因E165R为研究对象，分析其启动子甲基化等的特性。虽然ASFV基因型较多，但是ASFV的E165R基因启动子序列较保守；通过在线软件分析预测到ASFV基因的3个潜在启动子活性中心，说明预测的E165R启动子在理论上具有活性，将来还需进一步克隆其启动子并验证活性。此外，在启动子上预测到了常见的一些转录因子，例如c-Jun、c-Fos、GCN4、Sp1、C/EBPalp[17,18]等。值得注意的是，在转录因子Sp1和Oct-1的结合区域上含有cg甲基化位点，如果这些结合位点发生甲基化则会抑制转录因子与启动子的结合，最终抑制E165R基因启动子激活从而限制蛋白的合成。

DNA甲基化的检测方法有BSP（重亚硫酸氢盐测序法）和MSP（甲基化特异性检测法）等。BSP是甲基化检测的金标准，优点是检测结果准确、可信度高；缺点是成本较高[5]。MSP的检测方法主要优点是快捷迅速、成本低；但是，MSP对于半甲基化的基因不易区分甲基化水平的高低。本文针对E165R启动子序列成功设计了甲基化检测引物，包括BSP和MSP。

4 小结

研究中对E165R基因启动子进行了生物信息学分析，预测到了E165R基因的启动子活性区域、启动子转录因子及甲基化区域。此外，本文对ASFV的复制相关基因E165R启动子设计了甲基化检测引物，为将来在甲基化方向深入研究ASFV的感染复制机理打下了基础。