外周血T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3和血清乳酸脱氢酶联合检测在骨髓增生异常综合征诊断中的应用价值

李荣芳，金 龙，赵立丹

(西安市第九医院老年病科，陕西 西安 710054)

骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic syndrome，MDS)是造血干细胞恶性疾病，早期主要表现为骨髓造血干细胞凋亡、分化成熟障碍等，中期主要表现为恶性克隆性原始细胞凋亡数量减少，呈现向急性白血病转化的特点[1]。该病常见于老年人群，发病相对隐匿，常导致临床漏诊及误诊，增加急性白血病的发生风险[2-3]。另外， MDS患者中约90%在确诊时骨髓呈现增生性活跃状态，伴随外周血细胞水平降低，此为无效造血，可严重危及患者生命健康[4]。MDS的诊断与治疗一直是国内外血液病领域的研究热点，但目前仍缺乏灵敏度高、特异性好的分子标志物或检测手段来识别恶性克隆。研究[5]证实，MDS发病机制包括：造血干细胞分子遗传变异，产生异常前体细胞[6]；体内细胞免疫等免疫监视失能，异常克隆免疫逃逸/耐受。部分研究[7]发现，T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3，TIM-3)在MDS造血干细胞上过度表达。李雯雯等[8]则指出，MDS患者血清乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)与疾病的进展与预后相关，监测该类指标对于患者的诊治具有一定的提示性。虽然TIM-3在血液疾病等方面研究报道较多，但不同研究间存在一定的差异性[9]。本研究对MDS患者外周血TIM-3和LDH表达水平进行检测，以分析二者在MDS诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取西安市第九医院老年病科2020年1月至2021年1月收治的98例MDS患者作为MDS组，其中男性52例，女性46例；年龄35～64岁，平均(56.36±7.23)岁；体重48～61 kg，平均(55.36±5.15)kg；依据MDS国际预后积分系统[10]，低危41例，中危35例，高危22例。病例纳入标准：①符合MDS诊断标准[11]，排除其他造血及非造血系统疾病；②无认知、精神障碍；③配合度较高。排除标准：①心、肝、肾等脏器功能障碍；②合并免疫系统疾患；③患有其他恶性肿瘤。选取同期36名健康体检者作为对照组，其中男性19例，女性17例；年龄36～65岁，平均(57.00±7.47)岁；体重45～61 kg，平均(55.82±5.41)kg。两组一般资料比较无统计学差异(均P>0.05)。数据均选自本院一批次验证测试的验证计划。

1.2 检测方法

1.2.1 外周血单核细胞(PBMC)表面TIM-3表达水平检测：对照组于体检当日、MDS组于入院第1天采集空腹静脉血4 ml，EDTA抗凝，每管加入红细胞裂解液2 ml，避光反应5 min，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤1次，离心弃上清后PBS重悬备用。取制备好的PMBC悬液100 μl，将每例样本分为空白对照组、阴性对照组和实验检测组(空白对照组不加任何试剂，阴性对照组只加各类抗体，实验检测组加PBMC悬液和各类抗体)，分别吸取荧光标记的抗体(CD4、TIM-1、TIM-3抗体)各5 μl加入流式管混匀，室温避光孵育15 min，PBS洗涤1次，离心弃上清后加入200 μl PBS重悬液，采用FACS Calibur型流式细胞仪检测TIM-3表达水平。TIM-3试剂盒(批号：F02731；规格：96 T)购自上海西唐生物科技有限公司。

1.2.2 LDH表达水平检测：对照组于体检当日、MDS组于入院第1天采集空腹静脉血3 ml，EDTA抗凝，于2 h内送至检验科，3500 r/min(离心半径15 cm)离心10 min，分离血清后取0.5 ml分装于EP管内，于冰箱-80 ℃保存待测。选用日立760全自动生化仪，采用速率法对LDH水平进行测定。LDH正常参考值为218～458 U/L。

2 结 果

2.1 两组TIM-3和LDH表达水平比较 见表1。与对照组相比，MDS组TIM-3和LDH表达水平更高(均P<0.05)。

表1 两组TIM-3和LDH表达水平比较

2.2 不同预后分级MDS患者TIM-3和LDH表达水平比较 见表2。不同预后分级MDS患者TIM-3和LDH表达水平比较差异无统计学意义(均P>0.05)。

表2 不同预后分级MDS患者TIM-3和LDH表达水平比较

2.3 TIM-3、LDH单项及联合检测诊断MDS效能分析 见表3(图1)。TIM-3单项诊断MDS的敏感性与特异性分别为70.10%、69.40%，LDH则为62.89%、77.80%。TIM-3、LDH联合检测诊断MDS的敏感性与特异性分别为88.70%和68.12%，二者联合检测诊断价值高于单项指标检测。

表3 TIM-3、LDH单项及联合检测诊断MDS效能分析

图1 TIM-3、LDH单项及联合检测诊断MDS ROC曲线

3 讨 论

MDS以无效造血和易转化为急性髓系白血病为特点[12-14]。TIM-3属于免疫球蛋白TIM家族，小鼠中TIM家族包括TIM-1至TIM-8，而在人类基因中只鉴定出TIM-1/3/4。TIM-3基因定位于人类染色体5q33.2，其功能与信号转导有关[15]。随着研究的深入，国内外学者发现TIM-3还可以表达在自然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞、肥大细胞和其他淋巴细胞亚群上，并且对细胞因子和趋化因子的分泌起着重要调节作用，在病毒性感染、自身免疫病、肿瘤免疫逃逸、移植免疫耐受中均发挥重要作用。诸多研究[16-17]指出，TIM-3在肿瘤浸润性淋巴细胞中高表达，且这种高表达多与肿瘤密切相关。当TIM-3调节固有免疫反应时，并不直接作用于半乳糖凝集素9(Gal9)，而是通过与高迁移率族蛋白 B1结合而引起后续免疫应答[18]。此外，TIM-3还可与主要作用于凋亡细胞的磷脂酰丝氨酸配体相结合，在消除体内凋亡细胞和维持内环境稳定方面发挥作用。LDH参与机体糖、脂、蛋白等多种重要物质代谢[19]，其广泛存在于人体心、肾、骨骼肌等中，正常人血清中含量极少[20]。LDH水平在血液系统常见恶性肿瘤如MDS、白血病、多发性骨髓瘤、噬血细胞综合征、淋巴瘤等中均有不同程度升高[21]。本研究中，与对照组相比，MDS组TIM-3和LDH表达水平明显更高，提示MDS患者TIM-3和LDH表达水平出现了异常。MDS此类疾患的细胞遗传学特点为细胞基因突变发生率甚高，由之产生的能量代谢障碍及细胞损伤可能是导致该类患者体内LDH升高的原因。MDS患者通常伴有贫血，肿瘤坏死及炎症因子的释放等易使细胞处于缺氧环境下，无氧酵解加重代谢产物蓄积与代谢紊乱，也可能导致LDH加速释放入血。在绝大多数血液疾病的异常造血干细胞上，TIM-3均高表达，提示TIM-3可能是急性髓系白血病造血干细胞的标志物。

同时，本研究还探究了TIM-3和LDH在MDS疾病中的诊断价值，发现TIM-3、LDH联合检测诊断MDS的敏感性与特异性分别为83.67%和91.67%，诊断效能均显著高于TIM-3、LDH单项检测。由此我们可以认为，MDS患者体内TIM-3、LDH表达水平均升高，二者联合检测有助于提高MDS的临床诊断效能。冯爱梅等[22]认为，LDH具有维持其肿瘤、白血病细胞生长的作用。考虑到白血病、巨幼细胞性贫血以及MDS患者均会出现LDH水平升高的现象，故仅将LDH作为MDS的诊断参考指标存在一定局限性，易造成漏诊或者误诊的情况出现。生理条件下，造血微环境中分泌的细胞因子、趋化因子等，以及其中的细胞成分包括骨髓间充质干细胞、血管内皮细胞、成骨细胞、单核巨噬细胞可通过与造血干、祖细胞之间的交流而维持正常造血，而疾病状态下微环境中失调的炎症因子可扰乱造血干细胞正常功能，有利于肿瘤细胞的异常累积[23]。人体内的TIM-3可以调控巨噬细胞的免疫应答，降低M1型巨噬细胞极化，减轻M1型巨噬细胞浸润，同时TIM-3的特异性配体Gal9对促炎或趋化因子等也均有抑制作用[24]，故TIM-3表达水平一定程度上可以反映MDS疾病的严重程度。TIM-3与LDH联合检测可以弥补LDH等血液常规指标在疾病诊断中的不足之处，进而帮助临床医师准确对患者进行诊治。本研究中，不同预后分级患者的TIM-3和LDH表达水平比较差异无统计学意义，可能与研究纳入样本量较少有关，具体机制有待进一步研究。

综上所述，MDS患者外周血TIM-3和LDH表达水平异常升高，二者联合检测有助于提高对MDS疾病的诊断准确率，方便医师后续治疗计划与方案的拟定与实施。