大黄、赤芍注射液对急性肝衰竭模型大鼠肝功能、肝再生指标的影响及机制研究

张荣臻，吕 超，王 娜，陈月桥，毛德文

(广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023)

急性肝衰竭(Acute liver failure，ALF)是由肝细胞大量死亡造成肝功能严重障碍，并在2周内出现Ⅱ度以上肝性脑病的临床综合征，可出现肝功能异常、黄疸、肝脏生化指标异常、凝血功能障碍等， 28 d内病死率超过50%[1-2]。其病因多种多样，药物(通常是对乙酰氨基酚)、化学毒素、病毒感染、酒精、代谢等均可导致ALF，肝切除和肝移植等肝脏手术后由于肝脏没有足够容量来维持肝再生也会引起ALF[3]。肝移植是治疗ALF的有效手段，因此了解肝细胞再生的病理生理机制对于治疗ALF有着重大的临床意义。既往研究[4]发现，大黄、赤芍可以改善肝衰竭大鼠肝功能，提高大鼠生存率，其作用机制可能与促进肝细胞再生相关。因此，观察大黄、赤芍注射液对ALF模型大鼠肝功能及肝再生指标的影响，并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级SD雄性大鼠120只，鼠龄2个月，体重190～240 g,由湖南长沙市天勤生物技术有限公司提供(动物生产许可证号：SCXK湘2014-0011)。饲养和实验均在广西中医药大学第一附属医院实验中心完成。动物饲养环境遵循实验中心条件，温度控制在24 ℃左右，光照时间按照12 h间隔，保持充足饲料和饮水，定期清理排泄物。

1.1.2 大黄注射液：取大黄(购自广西仙茱中药科技有限公司)粉末1 kg，70%乙醇12倍量，提取2次，每次30 min。抽滤后合并滤液，回收乙醇并浓缩至无醇味，加入95%乙醇至含醇度80%，静置24 h，抽滤。滤液以20% NaOH调节pH至8，冷藏24 h，滤过。滤液以10% HCl调节pH至5～6，回收乙醇至无醇味，得到大黄提取物。补加注射用水至100 ml，冷藏24 h，G3过滤后灌封、消毒。

1.1.3 赤芍注射液：取赤芍(购自广西仙茱中药科技有限公司)粉末1 kg，60%乙醇12倍量，提取30 min。抽滤后合并滤液，回收乙醇并浓缩至2000 ml。加入5%明胶250 ml，充分搅拌后静置24 h，抽滤。滤液加入95%乙醇至含醇度70%左右，静置24 h，抽滤。滤液回收乙醇并浓缩至1000 ml，浓缩液加入95%乙醇至含醇度85%，静置24 h，抽滤。回收乙醇至无醇味，补加注射用水至1000 ml，冷藏24 h，G3精滤后灌封、消毒。

1.1.4 其他试剂：促肝细胞生长素注射液(吉林敖东药业)，戊巴比妥钠注射液(北京华业寰宇化工有限公司)，Jak2(D2E12)XP®兔单克隆抗体(CST)，Phospho-Stat3(Tyr705)(D3A7) XP®兔单克隆抗体(CST)，兔抗-IL-6抗体(博奥森)，兔抗PCNA 抗体(bs-2006R)(博奥森)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备与分组：根据前期研究成果[5]构建ALF大鼠模型后，选取100只随机分为造模阳性对照组(对照组)，促肝细胞生长素组(生长素组)，大黄、赤芍低剂量组(低剂量组)，大黄、赤芍中剂量组(中剂量组)，大黄、赤芍高剂量组(高剂量组)，每组20只。

1.2.2 给药方法：参照文献[6]研究方法，以成人用药剂量为基础，按照相对体表面积换算。临床上大黄、赤芍成人每日给药量为15 g生药/60 kg，换算出大鼠对应给药量为1.46 g生药/kg，对应注射液静脉给药量为每日0.5 ml/100 g。实验前3 d至结束分别于尾静脉注射给药，1次/d，间隔24 h。低剂量组每日给予0.25 ml/100 g，中剂量组每日给予0.5 ml/100 g，高剂量组每日给予0.75 ml/100 g，对照组每日给予0.9%氯化钠溶液1 ml/100 g，生长素组参照文献每日给予促肝细胞生长素1 ml/100 g。实验中动物均饮用生理葡萄糖盐水(内含10%葡萄糖和0.9%氯化钠)。

1.2.3 标本采集：分别于造模后24、48 h从五组大鼠中随机各取6只采集相关组织样本。具体操作如下：①大鼠经1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定在手术台上，碘伏消毒后铺无菌孔巾。正中腹部切开，腹主动脉抽取EDTA抗凝血2 ml，3000 r/min离心5 min后收集血清及血浆各1管分装，-80 ℃保存，避免反复冻融。②抽血后剖取肝组织并快速放入PBS 中洗净，滤纸吸干，称重后10%甲醛液固定，将约100 mg肝组织装入冻存管放于液氮罐中冻存，约100 mg分装至RNAlater保存液EP管中，4 ℃冰箱保存过夜后转至-80 ℃超低温冰箱。

1.3 观察指标 比较造模后24、48 h各组大鼠血清肝功能指标[天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及总胆红素(TBIL)]及肝再生指标[有丝分裂指数(MI)、增殖指数(PI)以及增殖细胞核抗原(PCNA)]。

1.3.1 MI检测：将10%甲醛固定的肝组织标本进行梯度酒精脱水后包埋切片(5 μm)，再次使用常规酒精脱水、冲洗，进行苏木素和伊红染色，中性树胶封片后在光学显微镜下观察1000个肝细胞中有丝分裂细胞数目情况。MI=有丝分裂细胞数/1000×100%。

1.3.2 PI检测：大鼠采血后取下肝组织，剪下约黄豆大小的肝脏放入35 mm培养皿中，加入1640培养基2 ml，在培养皿中将肝脏轻轻研磨成细胞悬液。用巴氏吸管吸取研磨后的悬液，经200目尼龙膜过滤至15 ml离心管中，加1640培养基至10 ml， 2000 r/min离心10 min后弃上清，加入预冷的75%乙醇10 ml快速混匀，4 ℃过夜。2000 r/min离心10 min后弃上清，加入PBS 10 ml。上述步骤重复2遍，加入PI/Rnase 500 μl，4 ℃避光孵育30 min后过滤至流式管，上机收集PI通道荧光数据，导出fcs文件，通过modfit拟合分析细胞在各个时期的百分比。

1.3.3 PCNA检测：将包埋好的肝组织标本切片脱蜡，依次常规酒精脱水、冲洗，抗原修复，封闭，孵育一抗，孵育二抗，DAB显色，复染，脱水，封片镜检，中性树脂封片，显微镜下观察染色情况。染色后如果镜下观察细胞核显棕褐色，则为PCNA阳性。随机选取10个视野，每个视野观察100个细胞，总计观察1000个细胞，记录PCNA细胞阳性数量。

2 结 果

2.1 五组大鼠一般情况 五组大鼠在造模4～6 h后苏醒，表现出精神萎靡、行动迟缓、嗜睡等症状。12 h内只有对照组中1只大鼠死亡，其他组无死亡大鼠。药物干预组大鼠总体表现较对照组好。中剂量与高剂量组大鼠有腹泻现象，可能与大黄、赤芍剂量有关。

2.2 五组大鼠造模后24、48 h血清肝功能指标比较 见表1。造模后24 h，对照组ALT、AST、TBIL水平明显高于其他四组(均P<0.05)。造模后48 h，五组大鼠各指标水平均有所下降，对照组ALT、AST、TBIL水平仍明显高于其他四组(均P<0.05)。各药物干预组中，以低剂量组与生长素组肝功能指标降低最为明显，但组间比较无统计学差异(均P>0.05)。

表1 五组大鼠造模后24、48 h血清肝功能指标比较

2.3 五组大鼠造模后24、48 h MI和PI比较 见表2(图1)。造模后24、48 h，对照组MI明显低于其他四组，生长素组与低剂量组MI明显高于中、高剂量组(均P<0.05)。造模后24 h对照组PI低于其他四组，生长素组与低剂量组PI高于中、高剂量组(均P<0.05)。造模后48 h相比24 h各组PI均有一定提高，对照组PI仍低于其他四组(均P<0.05)，但其他四组间PI比较无统计学差异(均P>0.05)。

图1 五组大鼠造模后24、48 h肝组织HE染色结果(×40)

表2 五组大鼠造模后24、48 h MI和PI比较(%)

2.4 五组大鼠造模后24、48 h PCNA阳性细胞数比较 见表3(图2)。造模后24、48 h，低剂量组、高剂量组和生长素组PCNA阳性细胞数均高于对照组(均P<0.05)。

图2 五组大鼠造模后24、48 h肝组织免疫组化染色结果(×40)

表3 五组大鼠造模后24、48 h PCNA阳性细胞数比较(个)

3 讨 论

内科综合治疗、人工肝支持及肝移植是治疗ALF的常规方法。肝移植手术为目前终末期肝病治疗的唯一有效手段，其通常是在期望立即且充分的肝再生情况下进行的[7]。但是，如果没有发生肝再生，则会导致严重的肝衰竭和一般情况恶化，从而影响预后。因此，了解肝再生的生理病理特征对于疾病的治疗转归和预后无疑很重要，研究控制肝再生机制对于治疗肝衰竭、肝切除术及肝移植手术有着重大的临床意义，可有效减轻患者的病死率，提高其生存率及生存质量。肝再生可分为三个阶段，即启动期、增殖期和终止期。肝再生是一个复杂而精密的过程，与生长因子、氧化应激、免疫调节、炎症反应等密切相关[8-11]，其中涉及的多种因子及信号传导机制尚未明确，也需要医疗界不断深入探索、发现。

大黄具有多种作用，几乎可作用于肝衰竭发病的各个环节，是治疗肝衰竭的首选药[12]。当代肝病医家汪承伯教授重用赤芍治疗肝衰竭，也取得了良好疗效[13]。课题组在前期研究中发现大黄、赤芍注射液能够上调肝衰竭大鼠血清白细胞介素(IL)-6水平，活化JAK/STAT信号通路，改善肝衰竭大鼠的生存率[14-15]。大黄、赤芍可以提高大鼠肝组织中PCNA水平，促进血清中IL-6水平上升，提高术后大鼠存活率，促进肝细胞再生[4，16]。现代药理学研究表明，大黄的主要有效成分为蒽醌衍生物，其治疗ALF的主要作用机制包括增强淋巴细胞免疫功能、促进胆汁排放以及一定的抗感染作用等。赤芍中含有大量单萜苷，赤芍总苷是其主要有效成分[17]。芍药苷可通过降低肝组织丙二醛、活性氧、一氧化氮、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原型)氧化酶4的量及增加谷胱甘肽的量而避免肝氧化损伤[18]。

本研究显示，对照组大鼠精神萎靡、行动迟缓，药物干预组大鼠总体表现较对照组好。另外，造模后24、48 h，对照组ALT、AST、TBIL水平明显高于其他四组；对照组MI和PI均低于其他四组，生长素组与低剂量组高于中剂量组与高剂量组；低剂量组、高剂量组和生长素组PCNA阳性细胞数均高于对照组。这些结果表明干预药物均能够促进肝细胞活化和增殖，且以低剂量组与生长素组效果最佳。

综上所述，大黄、赤芍注射液可有效促进肝细胞增殖再生，提高大鼠存活率，其机制可能与提高大鼠肝细胞MI、PI、PCNA水平，促进肝细胞再生有关。前期研究[19]发现大黄、赤芍能够调控ALF大鼠血清IL-6水平，调节活化的JAK/STAT信号通路，改善肝衰竭大鼠生存率。由于IL-6/JAK/STAT3通路在肝切除术后对调节肝细胞增殖和生长起着关键作用，有助于稳定肝再生进程，促进肝细胞再生，而且补偿了必要的肝功能[20]。大黄、赤芍是否可以通过IL-6/JAK/STAT通路调控肝细胞再生从而提高ALF治愈率，有待进一步的研究。