LncRNA LINC00277通过与miR-27b结合调控p53表达抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移

宋殿芳 贾素敏 徐冲

(滨州医学院附属医院 1妇产科，山东 滨州 256600；2临床实验中心)

宫颈癌是女性中常见恶性肿瘤之一，其已严重威胁女性健康，宫颈癌早期诊断准确率较低与患者预后差是亟待解决问题，研究表明宫颈癌发生与人乳头状瘤病毒感染相关，而单独人乳头状瘤病毒感染并不是引起宫颈癌的主要原因〔1〕。既往研究显示原癌基因激活与抑癌基因失活及其涉及多种信号通路可参与宫颈癌发生及发展过程〔2〕。长链非编码RNA(LncRNA)可参与基因转录激活、染色质修饰等多种过程，并可参与乳腺癌、肝癌及宫颈癌等发生及发展过程〔3〕。LncRNA LINC00277在人乳头状瘤病毒诱导的宫颈癌形成过程中表达下调，但关于其具体作用机制尚未可知〔4〕。研究表明HPV16 E7可通过调控miR-27b进而影响宫颈癌细胞增殖及凋亡〔5〕。miR-27b-3p在宫颈癌中上调表达，并可促进癌细胞增殖及迁移〔6〕。p53属于抑癌基因，p53在许多癌症中发挥抑癌作用〔7〕。通过生物学信息网站预测miR-27b可能是LINC00277的靶基因，p53可能为miR-27b的靶基因，但LINC00277是否可通过调控miR-27b/p53进而参与宫颈癌发生及发展过程尚未可知。因此，本研究着重探讨LINC00277在宫颈癌细胞中的表达及其对细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响，分析其对miR-27b/p53的调控作用，为揭示宫颈癌发病机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2015年3月至2017年2月山东省滨州医学院附属医院就诊的宫颈癌患者36例为研究对象，所有患者经手术病理证实为宫颈癌，年龄55～70〔平均(63.25±6.26)〕岁，纳入标准：宫颈癌病理类型均为腺癌；生存时间超过6个月；患者病理分期为Ⅱ期或Ⅲ期患者〔8〕；依从性强。排除标准：术前接受放疗、化疗等；合并其他恶性肿瘤者；既往心肌梗死等心血管疾病者；心、肾等脏器功能受损者。本研究经医院伦理委员会批准，患者及其家属知情且签署同意书。所有患者于术中切除宫颈癌组织(36例)及癌旁组织(28例)，迅速放入液氮中，术后将其转移至-80℃超低温冰箱保存。

1.2材料与试剂 宫颈癌细胞系Hela、SiHa与正常宫颈细胞系E6E7均购自中国科学院中国细胞库。DMEM培养基、胎牛血清与胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；miR-27b mimics及其阴性对照mimic-NC、miR-27b inhibitor及其阴性对照miR-NC均购自上海吉玛制药技术有限公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测试剂盒、蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、ECL试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Annexin V-FITC/PI双染试剂盒购自上海钰博生物科技有限公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；目的质粒pcDNA3.1与空白质粒pcDNA3.1均购自上海吉凯基因化学技术有限公司；兔抗人p53抗体购自美国CST公司；Trizol、反转录及qRT-PCR试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1细胞转染及分组 取对数生长期宫颈癌Hela细胞，接种于6孔板，放入不含血清及青链霉素的DMEM培养基内培养，待细胞融合度达到50%时按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书进行转染，将pcDNA-LINC00277、pcDNA-NC、miR-27b mimics、mimic-NC、miR-27b inhibitor、miR-NC分别转染至宫颈癌Hela细胞，分别为pcDNA-LINC00277组、pcDNA-NC组、mimic-miR-27b组、mimic-NC组、inhibitor-miR-27b组、miR-NC组，同时将pcDNA-LINC00277与mimic-miR-27b共转染至宫颈癌Hela细胞，pcDNA-LINC00277与miR-NC共转染至宫颈癌Hela细胞，分别为pcDNA-LINC00277+mimic-miR-27b组、pcDNA-LINC00277+miR-NC组，转染6 h后更换培养基为含有10%胎牛血清及青链霉素的DMEM完全培养基，继续培养48h，将转染成功的细胞用于实验。

1.3.2qRT-PCR检测细胞中LINC00277、miR-27b表达水平 收集宫颈癌组织及癌旁组织，研磨后加入Trizol试剂提取组织RNA，同时收集各组细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，参照反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板配置qRT-PCR反应体系，qRT-PCR反应条件为95℃ 2 min，(95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s)×40次循环，采用2-ΔΔCt法计算LINC00277、miR-27b相对表达量。

1.3.3MTT检测细胞增殖 收集对数生长期宫颈癌Hela细胞，调整细胞浓度为5×104个/ml，按照每孔1×104个细胞的密度接种于96孔板，按照1.3.1转染后，放入37℃恒温培养箱继续培养，每孔分别加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，继续培养4 h后，弃上清，每孔分别加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，分别于溶解后的0 h、24 h、48 h、72 h时放入酶标仪检测450 nm处各孔吸光度值(OD)。实验均设置3次重复。

1.3.4流式细胞术检测细胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI双染法检测各组对数生长期宫颈癌Hela细胞凋亡率，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤宫颈癌Hela细胞，4℃，1 000 r/min转速离心5 min(离心半径6 cm)，加入PBS洗涤细胞，4℃，1 000 r/min转速离心5 min(离心半径6 cm)，弃上清，加入200 μl结合缓冲液，分别加入5 μl Annexin V-FITC与PI，充分混匀，室温避孵育20 min，加入400 μl结合缓冲液，于1 h内上机检测，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.5Transwell实验检测细胞迁移及侵袭 用100 μl无血清DMEM培养基稀释800 μl Matrigel基质胶，取100 μl稀释液铺于Transwell小室上室，取含胎牛血清DMEM培养基500 μl加入Transwell小室下室，放入37℃恒温培养箱内继续培养24 h，擦去未侵入细胞表面的细胞，采用多聚甲醛固定侵入Transwell小室下室的细胞20 min，0.1%结晶紫染色10 min，干燥后置于显微镜下拍照并计算侵袭细胞数。细胞迁移实验：取不含血清的DMEM培养基100 μl放入Transwell小室的上室，取含胎牛血清DMEM培养基500 μl加入Transwell小室下室，其余步骤同细胞侵袭实验，在显微镜下观察迁移细胞数。

1.3.6Western印迹检测p53蛋白表达 收集各组细胞，加入RIPA、PMSF裂解液，冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度，取20 μg蛋白样本进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将分离的蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温下使用5%脱脂奶粉封闭1 h，孵育一抗(1∶1 000)，4℃条件下孵育24 h，TBST洗膜3次×5 min，室温条件下孵育二抗(1∶5 000)1 h，TBST洗膜3次×5 min，滴加ECL发光显影，应用Image J软件分析条带灰度值。

1.3.7双荧光素酶报告基因实验验证LINC00277、miR-27b及p53的靶向关系 使用生物信息学数据库对LINC00277的靶基因进行预测，构建含有LINC00277与miR-27b的结合位点的野生型载体LINC00277-wt，构建含有LINC00277与miR-27b突变结合位点的突变型载体LINC00277-mut，同时将宫颈癌Hela细胞接种于24孔板，待细胞汇合度达到80%左右时将LINC00277-wt与miR-27b mimics或miR-NC分别共转染入宫颈癌Hela细胞，将LINC00277-mut与miR-27b mimics或miR-NC分别共转染入宫颈癌Hela细胞。使用生物信息学数据库对miR-27b的靶基因进行预测，构建含有p53与miR-27b的结合位点的野生型载体p53-wt，构建含有p53与miR-27b突变结合位点的突变型载体p53-mut，同时将宫颈癌Hela细胞接种于24孔板，待细胞汇合度达到80%左右时将p53-wt与miR-27b mimics或miR-NC分别共转染入宫颈癌Hela细胞，将p53-mut与miR-27b mimics或miR-NC分别共转染入宫颈癌Hela细胞。转染后，各组细胞放入37℃恒温培养箱继续培养24 h，取出培养板，每孔分别加入60 μl细胞裂解液，低速振荡20 min，参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组细胞荧光素酶活性。

1.4统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1LncRNA LINC00277在宫颈肿瘤组织、肿瘤细胞系中的表达量 LINC00277在宫颈癌组织中的表达水平(0.52±0.05)显著低于癌旁组织(1.95±0.20，P<0.05)；宫颈癌Hela、SiHa细胞中LINC00277的表达水平(0.75±0.08，0.83±0.06)均显著低于E6E7细胞(2.41±0.21，P<0.05)，其中在宫颈癌Hela细胞中LINC00277的表达水平降低最为显著。因此后续实验中选取宫颈癌Hela细胞为研究对象。

2.2LncRNA LINC00277在体外的表达量对细胞增殖和活力的影响 pcDNA-LINC00277组宫颈癌Hela细胞增殖活性低于pcDNA-NC组(P<0.05)，细胞凋亡率高于pcDNA-NC组(P<0.05)，见图1和表1。

图1 过表达LINC00277时细胞的凋亡率

表1 过表达LINC00277对Hela细胞增殖活性的影响

2.3LncRNA LINC00277在体外的表达量对细胞的迁移和侵袭能力的影响 pcDNA-LINC00277组细胞迁移及侵袭细胞数均显著低于pcDNA-NC组(均P<0.05)，见图2和表2。表明LINC00277过表达可抑制宫颈癌Hela细胞迁移及侵袭能力。

图2 过表达LINC00277对细胞迁移力和侵袭力的影响(结晶紫染色，×200)

表2 过表达LINC00277对细胞迁移力和侵袭力的影响个)

2.4LncRNA LINC00277可以靶向miR-27b 宫颈癌Hela细胞中miR-27b的表达水平(1.27±0.12)显著高于正常宫颈细胞E6E7(0.56±0.05，P<0.05)。靶基因预测网站显示miR-27b与LINC00277的3′UTR存在结合位点，见图3。

图3 LINC00277和miR-27b的结合位点

双荧光素酶报告基因实验结果显示，与mimic-NC、LINC00277-wt共转染组相比，mimic-miR-27b、LINC00277-wt共转染组细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，见表3。pcDNA-LINC00277组miR-27b的表达水平(0.52±0.05)显著低于pcDNA-NC组(1.46±0.13，P<0.05)。

表3 双荧光素酶报告实验

2.5miR-27b可靶向调控p53表达 双荧光素酶报告基因实验结果显示，与mimic-NC、p53-wt共转染组相比，mimic-miR-27b、p53-wt共转染组细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，见表4。靶基因预测网站显示miR-27b与p53的3′UTR存在结合位点，见图4。Hela细胞中p53的表达水平(0.68±0.06)显著低于正常宫颈细胞E6E7(1.53±0.12，P<0.05)。inhibitor-miR-27b组宫颈癌Hela细胞中p53的表达水平显著高于inhibitor-miR-NC组(P<0.05)，见图5和表5。

表4 双荧光素酶报告实验

图4 miR-27b和p53的结合位点

图5 Western印迹检测干扰miR-27b对p53蛋白表达水平的影响

表5 干扰miR-27b对p53表达量的影响

2.6LINC00277可与miR-27b结合调控p53的表达来抑制肿瘤细胞的侵袭和转移 pcDNA-LINC00277+mimic-miR-27b组p53的表达水平显著低于pcDNA-LINC00277+miR-NC组(P<0.05)，细胞增殖活性高于pcDNA-LINC00277+miR-NC组(P<0.05)，迁移及侵袭细胞数显著多于pcDNA-LINC00277+miR-NC组(P<0.05)，见表6。

表6 LINC00277可与miR-27b结合调控p53的表达来抑制肿瘤细胞的增殖活力、迁移和侵袭

3 讨 论

人乳头状瘤病毒的预防性疫苗可有效预防宫颈癌，但其对宫颈癌晚期患者治疗效果较差，目前宫颈癌发病机制尚未完全阐明〔9〕。因而探究宫颈癌细胞迁移及侵袭的分子机制并寻找有效诊断的分子治疗靶点对提高宫颈癌治疗效果有重要意义。研究表明LncRNA在多种恶性肿瘤中异常表达并可参与肿瘤发生及发展过程〔10〕。已有报道指出LncRNA GAS5、LncRNA H19等表达异常可能参与宫颈癌发生及发展过程，并可为宫颈癌分子靶向治疗提供理论依据〔11〕。

本研究结果说明LINC00277在宫颈癌中呈低表达并可能发挥抑癌基因作用。LINC00277过表达可通过降低宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力及增强细胞凋亡能力进而抑制宫颈癌发生及发展。研究表明miR-27b在乳腺癌细胞中呈低表达，并可通过靶向抑制HMG3表达进而抑制乳腺癌细胞上皮-间质转化〔12〕。miR-27b在口腔鳞癌细胞中表达降低，上调miR-27b表达可通过靶向抑制FZD7表达进而抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖〔13〕。miR-27b通过靶向NR2F2抑制胃癌细胞迁移及侵袭〔14〕。但miR-27b在宫颈癌细胞表达上调，并可促进细胞生长，细胞周期从G1期向S期转变，侵袭及减少细胞凋亡〔15〕。LncRNA ZEB2-AS1可通过调节miR-27b进而促进膀胱癌细胞增殖及抑制细胞凋亡〔16〕。这可能与肿瘤细胞类型不同相关。提示LINC00277可能通过竞争性吸附miR-27b而抑制miR-27b表达进而抑制宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭并诱导细胞凋亡。

miRNA通过靶向抑制下游靶基因表达进而参与多种肿瘤发生及发展过程，通过靶基因预测显示p53可能是miR-27b的靶基因，通过双荧光素酶报告基因证实miR-27b可靶向结合p53，并可负向调控p53表达，研究表明上调p53表达可抑制宫颈癌细胞增殖并促进其凋亡〔17～19〕。二甲双胍可通过促进细胞周期蛋白D1和p53表达而抑制细胞增殖，并诱导宫颈癌细胞凋亡〔20〕。本研究结果提示LINC00277可通过调控miR-27b/p53表达进而抑制宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭。

综上，LINC00277过表达可通过抑制miR-27b表达而上调p53表达进而减弱宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，LINC00277可能成为宫颈癌潜在治疗分子靶点及预后的生物标志物，并可能应用于实时监控宫颈癌发病进展，为宫颈癌迁移及侵袭提供新的作用靶点。