羊巴贝斯虫病PCR鉴别诊断方法建立

刘玉海

摘要：羊的巴贝斯虫病是世界范围内严重影响养羊业发展的重要寄生虫病，快速检测是有效防控该病的重要措施之一。本研究将以甘肃省分离的一株羊的巴贝斯虫为研究对象，在纯化的裂殖子中提取基因组DNA，根据18S rRNA基因序列设计特异性引物进行扩增，结果获得羊巴贝斯蟲的目的基因片段199 bp。同时以羊的吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和干净羊的基因组作为对照进行扩增，结果均无交叉反应，表明该PCR方法有很好的特异性，可用于羊巴贝斯虫病临床和流行区感染的早期检测和诊断。

关键词：羊巴贝斯虫;PCR;检测方法

中图分类号：S858.26文献标识码：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2021.22.001

Establishment of PCR Differential Diagnosis Method for Babesiosis in Sheep

LIU Yuhai

（Animal Husbandry Technical Service Center of Longxi County，Animal Husbandry and Veterinary Station of Biyan Town，Longxi Gansu 748107，China）

Abstract：Babesiosis in sheep is an important parasitic disease that seriously affects the development of sheep farming worldwide. Rapid detection is one of the important measures to effectively prevent and control the disease. In this study，a sheep Babesia isolated from Gansu Province was taken as the research object，the genomic DNA was extracted from the purified merozoites，and specific primers were designed according to the 18S rRNA gene sequence for amplification. The target gene fragment is 199bp. At the same time，the genomes of T. lutii，T. eustii and clean sheep were used as controls for amplification，and the results showed no cross-reaction，indicating that the PCR method has good specificity. It can be used for early detection and diagnosis of babesiosis infection in clinical and endemic areas.

Keywords：sheep Babesia，PCR，detection method

0引言

巴贝斯虫病是由巴贝斯属的不同种病原寄生于哺乳动物红细胞内引起的以贫血、消瘦、黄疸为特征的一种血液寄生虫病。该病与泰勒虫病，无浆体病都是由生物媒介蜱传播而引起，故同称为蜱传病。截至目前，世界范围内已报道的羊巴贝斯虫病的病原种类有莫氏巴贝斯虫、羊巴贝斯虫、泰氏巴贝斯虫、粗糙巴贝斯虫和叶状巴贝斯虫等5个种[1]。

羊巴贝斯虫病是由顶复门、梨形虫纲、梨形虫目的巴贝斯科巴贝斯属的巴贝斯虫寄生于羊红细胞内引起的一类疾病。该病以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿为主要临床特征，感染严重时可引起羊只的死亡[2]。该病在我国分布广泛，危害严重，常常给疫区的养羊业造成巨大的经济损失。由于该病病原寄生部位的特殊性，临床很难根除。因此，建立及时有效的检测方法是预防和控制该病发生与流行的主要手段之一。对于羊巴贝斯虫病的鉴别诊断方法，目前主要有经典的病原学方法，吉姆萨染色血液涂片进行显微镜检查，血清学检测抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法。但由于不同的诊断方法都有其自身的缺陷，血液原虫病原学诊断方法、显微镜镜检和血清学ELISA检测方法的敏感性较低，很难进行羊巴贝斯虫种的鉴别诊断。近年来随着分子生物学技术的快速发展，越来越多的分子生物学检测方法被不断地应用于巴贝斯虫不同种的鉴别诊断中。

聚合酶链式反应（PCR）是实验室最常见的用于检测巴贝斯虫病的分子生物学方法之一。该方法是通过一对特异性引物对靶标基因进行体外核酸扩增，从而获得大量复制的目的基因。尤其适用于动物感染后表现为亚临床症状或染虫率较低的时候，与传统的血液涂片镜检法相比，具有更高的敏感性。Altay等[3]建立的以绵羊巴贝斯虫核糖体18SrRNA为靶基因的PCR方法，不但能特异性检测羊巴贝斯虫的感染，而且在敏感性和特异性方面都具有很好的优势。与其它诊断方法相比，PCR检测方法更加简单，且容易操作，已在国内外被广泛应用于不同病原的检测中。

本研究根据巴贝斯虫核糖体18SrRNA基因序列的保守区，设计特异性引物，建立检测羊巴贝斯虫的PCR方法，其特异性强，敏感性高，重复性好，可应用于该病的临床检测。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料

羊的巴贝斯虫虫血采自甘肃省的发病羊。野外采的虫血接种实验室除脾羊，待染虫率升高到5%～20%时，颈动脉放血，收集血液纯化裂殖子，提取基因组DNA，用于本试验。

1.1.2试剂耗材

DNA提取试剂盒购自Qiagen公司，DNA凝胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1虫体基因组DNA提纯

使用DNA提取试剂盒（Gentra公司），按操作说明书进行，从纯化的裂殖子中提取基因组DNA 80 uL，以备后续实验之用。

1.2.2PCR引物的设计与合成

根据GenBank登录的羊巴贝斯虫目的基因序列，经同源性分析比较后，选择基因中高度保守的V4区域，应用Primer Premier 5.0生物信息学软件，设计出适合检测该病原的特异性引物，送上海生工生物科学技术有限公司合成。所设计的引物序列如下：上游引物（POB1）：5'-TACCGTCAAGCTGATGGGG-3;下游引物（POB2）：5'-ATGGCTCATTACAACAGTTATAG-3'。

1.2.3引物稀释与配制

先将引物用双蒸水，配制成100 μM的储存液，待完全溶解后，吸取2μL于PCR管中，加入18μL双蒸水配制成10 μM的稀释液备用。

1.2.4PCR引物反应条件（退火温度）筛选

PCR反应条件筛选所用试剂均购自TakaRa公司，退火温度在55.5～59.0 ℃设立温度梯度PCR扩增体系见表1。

1.2.5目的片段的PCR扩增及电泳鉴定

以羊巴贝斯虫的基因组为模板，分别以羊的吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、健康羊基因组和纯净水作为对照，用已设计的引物进行PCR扩增，用TakaRa公司生产的试剂盒。PCR扩增的反应体系及程序如下表（混合后将体系离心10s）。置于PCR扩增仪中按照表2设计的程序进行扩增;之后取上述PCR产物5.0 rL，在2.0%的琼脂糖凝胶中，于120 V电压、120 mA电流下进行电泳分析，观察结果。

2结果与分析

2.1退火温度筛选结果

PCR扩增结果显示，在56.0～59.0 ℃时，目的片段的条带亮度相同，故取中间温度57.5 ℃为最适退火温度，见图1。

2.2羊巴贝斯虫目的基因片段的扩增及鉴定

以甘肃省分离的一株羊巴贝斯虫基因组为模版，运用该PCR引物进行扩增。结果扩增出了与预期大小相一致的199 bp的片段，见图2，表明目的片段扩增成功。

2.3羊巴贝斯虫引物特异性的确定

使用本研究所设计的扩增羊巴贝斯虫的引物，分别以感染羊的吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫的虫血和干净羊的血液所提取的基因组为模板进行PCR扩增，结果显示吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫基因组及干净羊血液基因组三者均呈阴性，只有羊巴贝斯虫基因组呈阳性，表明羊的巴贝斯虫与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫之间没有交叉抗原，说明该引物的特异性较好，可用来检测鉴别感染羊的巴贝斯虫。见图3。

2.4羊巴贝斯虫目的片段测序结果分析

对羊巴贝斯虫所扩增的目的片段进行测序，199 bp片段的核甘酸序列如图4所示。

2.5田间样品验证PCR方法的敏感性

用本实验所建立的普通PCR方法和经典的病原学血液涂片检查方法，对采自甘肃省不同地区58份羊的血液样本分别进行检测。检测结果显示，常规PCR方法检出的阳性率为39.6%（23/58），而病原学血液涂片检出的阳性率为18.9%（11/58），且血液涂片镜检确定为阳性的样品，常规PCR方法检测也均为阳性，结果一致。该田间样品验证方法表明PCR检测方法敏感性更高。

3讨论

羊巴贝斯虫病是一种媒介蜱传播的血液寄生原虫病。动物感染该病后，主要的临床症状表现为发热、贫血、黄疸和血红蛋白尿，严重感染时可引起羊只死亡。我国最早报道羊巴贝斯虫病是20世纪80年代，首先发现报道于四川和黑龙江两省，此后相继于我国的河南、山西、甘肃和云南等省份被发现。利用所建立的酶联免疫吸附试验，即血清学方法，对采自我国22个省份的羊血清进行抗体检测，从而对我国羊巴贝斯虫的感染状况进行了流行病学调查;杨强等[6]对采自我国10个不同省份的羊血液进行了羊巴贝斯虫分子流行病学调查。上述两项不同实验方法的调查结果显示：羊巴贝斯虫病在我国的流行范围广泛、感染率较高，对我国的养羊业造成巨大的经济损失。

在临床诊断上，可根据羊巴贝斯虫病的临床症状和流行病史2方面综合考虑，对该病做出初步诊断。如患病动物是否表现出常见的高热、贫血、血红蛋白尿和食欲减退、精神萎靡等症状，患病动物的发病季节、发病地点和是否有蜱叮咬史等流行病学数据。但若要确诊，必须查到病原。确诊羊巴贝斯虫病惯常用的诊断方法主要是病原学检查方法，也就是血液涂片染色镜检法。但由于吉姆萨染色剂配制的不同，相似病原体很难明显区分，而且做显微镜镜检的人员专业知识的参差不齐等人为因素也影响镜检结果的判定;其次，该方法的缺陷在于，当感染动物处于带虫期或感染初期以及隐性感染阶段时，血液染虫率较低，此时在显微镜下很难在血液涂片中查到虫体;加之各种巴贝斯虫或者泰勒虫在形态上较为相似，所以显微镜检测易出现漏检和误诊的情况。故与之相对应的血清学检测方法被用于该病的抗体检测中。

4结论

以Genbank中登陆的羊巴贝斯虫的18SrRNA为靶标基因序列，设计一对特异性检测的核甘酸引物，建立了一种高敏感性和特异性的普通PCR方法，为羊巴贝斯虫病的隐性感染提供了一种快速定性诊断的分子生物学检测方法，适合血液寄生虫病的定性检测。该普通PCR方法为我国羊巴贝斯虫病的流行病学调查提供了有力的工具，不失为一种在基层防疫部门推广应用的合理方法。

参考文献

[1]殷宏，罗建勋，呂文顺，等.莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫在我国的分离及形态学观察测[J].中国兽医科技，1997，27（10）：7-9.

[2]刘爱红.建立于18SrRNA基因测序基础上的羊巴贝斯虫分子分类学研究[D].兰州：甘肃农业大学，2003.

[3]Altay K. Detection of Babesia ovis by PCR in Rhipicephalus bursa collected from naturally infested sheep and goats [J]. Research in Veterinary Science，2008，85（1）：116-119.