多黏菌素耐药性研究进展

李立，叶璟，胡蕾，谈林华

(浙江大学医学院附属儿童医院外科重症监护室 国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，杭州 310052)

多重耐药菌不断泛滥已在全世界引起很高的发病率和死亡率，成为现代医学亟待解决的重大问题。根据预测，到2050年每年将有约1 000万人死于耐药菌感染[1]。特别是耐碳青霉烯的肠杆菌科细菌，铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的暴发给抗菌药物的选择带来巨大挑战[2]。由于缺乏新的有效治疗药物，多黏菌素再次成为治疗多重耐药性的革兰阴性菌(Gram-negative bacteria,GNB)感染的最后一道防线[3]。

多黏菌素是由广泛分布于土壤的多黏芽孢杆菌产生的一种聚阳离子多肽[4]，属于多黏菌素类抗生素，具有亲水和亲脂的双亲性。根据多黏菌素化学结构的不同可分为多黏菌素A、B、C、D和E五个家族成员[5]。目前在临床上使用的仅为多黏菌素B和多黏菌素E(即黏菌素)两种。但随着多黏菌素的应用，其耐药菌株在世界范围内迅速出现[6]。Touati等[7]对北非黏菌素耐药流行病学进行系统的评价发现，这些耐药菌株广泛分布于农场动物的粪便、食物、环境样本及临床中。现对多黏菌素耐药性的研究进展予以综述，以期为应对多黏菌素耐药性传播提供新视角。

1 多黏菌素抗菌作用机制

GNB的外膜是维持细胞稳态的重要屏障。外膜表面脂多糖的存在限制了其疏水性和(或)大分子抗生素的渗透，对细菌起到保护作用。脂质A是脂多糖的重要组成部分，在细菌渗透性及与细胞外部交换中起重要作用[8]。多黏菌素带正电荷的二氨基丁酸残基通过静电作用与GNB外膜中脂多糖脂质A上带负电的磷酸基团竞争性置换脂多糖上的二价阳离子(Ca2+和Mg2+)，破坏脂多糖的三维结构，进而破坏GNB的细胞膜完整性，导致细胞内容物释放，引起细菌死亡。多黏菌素还可通过囊泡接触途径、羟自由基途径抑制细菌呼吸酶活性等机制起到杀菌作用[9-11]。

2 多黏菌素耐药机制

2.1染色体介导的黏菌素耐药性 GNB对多黏菌素耐药的机制较复杂，目前仍不明确[3]。脂多糖是多黏菌素的作用靶点，脂多糖的修饰改变会影响其对GNB的杀菌效果。通过阳离子基团4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖(4-amino-4-deoxy-L-arabinose,L-Ara4N)和(或)磷酸乙醇胺(phosphoethanolamine，PEtN)部分取代脂质A的磷酸基团可以实现对脂多糖的修饰[10-11]。脂多糖修饰的过程受双组分调控系统调节[12]。该调控系统及其调节器的突变会导致脂质A的磷酸基团被L-Ara4N、PetN阳离子基团取代，降低外膜的负电荷，阻碍多黏菌素与细菌的结合，减弱多黏菌素的杀菌作用[13]。GNB主要通过降低外膜的负电荷来实现对脂多糖的修饰作用，脂多糖的修饰涉及的基因和操纵子如下。

2.1.1pmrCAB操纵子、pmrHFIJKLM操纵子及pmrE基因 pmrCAB操纵子编码3种蛋白质：PEtN磷酸转移酶PmrC(又称eptA)，负责将pEtN基团添加到脂多糖上，因此PmrC过表达会影响多黏菌素与细菌外膜的结合，是黏菌素耐药性的主要原因之一；响应调节器PmrA(也称为BasR)；传感器激酶蛋白PmrB(也称为BasS)[14]。pmrCAB的突变可能会影响相关蛋白的表达，改变其对多黏菌的耐药性。有学者通过Sanger测序研究发现，pmrCAB中突变数量最高的是PmrB，其最常见的氨基酸变异是A138T，约占分离菌株的41%；而PmrC的突变是I42V和L150F[15]。Oikonomou等[16]研究发现，黏菌素敏感和耐药菌株中均存在pmrCAB的突变，表明鲍曼不动杆菌对多黏菌素耐药机制复杂，仅pmrCAB基因的突变不足以诱导其对多黏菌素的耐药性。pmrHFIJKLM操纵子(也称为arnBCADTEF或pbgPE操纵子)和pmrE基因负责阳离子基团L-Ara4N的合成并将其固定到脂质A上[17]。

2.1.2PmrAB双组分系统及crrAB操纵子 该系统编码调节蛋白PmrA和蛋白激酶PmrB两种蛋白，PmrB是一种具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，具有传感器特性，可以检测细胞膜Mg2+和Ca2+含量的变化、pH值改变及黏菌素等环境信号的变化[18]。受这些环境刺激，PmrB可通过磷酸化途径激活PmrA，活化的PmrA可依次激活pmrCAB操纵子、pmrHFIJKLM操纵子以及pmrE基因。pmrHFIJKLM操纵子和pmrE基因负责L-Ara4N和pEtN部分的合成及其与脂质A的结合[17]。

crrAB操纵子编码调控蛋白CrrA和传感器蛋白激酶CrrB两种蛋白。crrAB操纵子的生理作用机制仍不清楚。但crrB基因失活可导致pmrAB操纵子过表达，从而引起pmrHFIJKLM操纵子、pmrC和pmrE基因的激活，产生L-Ara4N和pEtN[19]。

2.1.3PhoPQ双组分系统及其调控基因mgrB 与PmrAB系统类似，环境刺激物(如巨噬细胞吞噬体、Fe2+、Al3+和pH值)可激活具有酪氨酸激酶活性的PhoQ，活化的PhoQ可通过磷酸化途径激活转录调节因子PhoP[20]。活化的PhoP驱动pmrHFIJKLM操纵子的转录，该操纵子通过向脂多糖中添加L-Ara4N参与脂多糖的化学修饰。同时，活化的PhoP还可以激活pmrA基因，从而触发PmrA蛋白的表达，将pEtN添加到脂多糖中[21-22]。

mgrB基因是一个长度为141个核苷酸保守基因，编码一个47个氨基酸的蛋白质MgrB[21]。该蛋白质对PhoPQ调节系统产生负反馈，降低其对黏菌素的耐药性。然而mgrB基因的失活或缺失引起phoPQ操纵子的过表达，导致pmrHFIJKLM操纵子激活，引起L-Ara4N生物合成，增加其对黏菌素耐药性[23]。mgrB基因突变是临床肺炎克雷伯菌耐药的主要原因，该耐药性是通过插入序列(IS5-like、IS1F、ISKpn13、ISKpn14、IS10R)或点突变实现[24]。

2.1.4lpxA、lpxC和lpxD基因 lpxA、lpxC和lpxD基因与脂质A生物合成有关，其突变失活会引起脂多糖合成障碍，导致多黏菌素的作用靶点丧失[25]。这组独特的基因存在于鲍曼不动杆菌，其突变会影响脂质A的生物合成，形成鲍曼不动杆菌对多黏菌素的高度耐药性。一项对21株体外培养的多黏菌素耐药性鲍曼不动杆菌独立型菌株ATCC 19606的分析表明，脂质A生物合成的3种基因(lpxA、lpxC、lpxD)均含有独特突变方式：单个碱基的改变、大片段的缺失和IS元件的插入[26]。其中IS Aba11和一个新型的IS4家族元件的替换、截断、移码或插入失活会导致脂多糖完全丧失，引起多黏菌素耐药。脂多糖是细菌的一种主要的毒力因子和主要结构成分，这种突变引起细菌结构变化的同时也会引起其毒力下降。上述机制通常会导致耐药性增加，但传播率较低。

另外，GNB对黏菌素的耐药机制还包括外排泵系统的孔蛋白突变和过表达、荚膜多糖的产生、黏菌素灭活酶等[24]。

2.2质粒介导的黏菌素耐药性 在临床分离获得的对多黏菌素具有耐药性的菌株仍较少。长期以来对多黏菌素耐药的机制均被归因于染色体突变，但这种耐药性不会在细菌间进行传播，不具备广泛流行的特点。直到2015年，中国学者在对食用动物大肠埃希菌抗生素耐药性例行监测时鉴定出第一个质粒介导的黏菌素可移动耐药基因mcr，命名为mcr-1[27- 28]。

mcr-1是一种PEtN脂质A转移酶，属于“YhjW/YjdB/YijP”碱性磷酸酶超家族[29]。目前共发现了22种mcr-1的遗传变异体[30]，包括mcr-1.1[27]、mcr-1.2[31]，直到mcr-1.22。这些变异体核苷酸和氨基酸具有高度一致性，对黏菌素的耐药机制也相似[30，32]。mcr-1介导黏菌素耐药性的机制与GNB固有耐药机制相同。mcr-1编码PEtN转移酶，促使PEtN加入脂多糖的脂质A上，从而增加脂多糖阳离子电荷，降低黏菌素对脂多糖的结合力[27，32-33]。

在国内，mcr-1的存在最早可追溯到20世纪80年代[34]。1970—2014年对鸡大肠埃希菌分离株的一项流行病学调查表明，大肠埃希菌mcr-1的携带率从2009年的5.2%增加到2014年的30.0%[34]。推测可能与我国此期间多黏菌素在畜牧业中的大量使用有关。而在一些尚未将黏菌素作为生长促进剂使用的国家(如美国及欧洲)食用动物中mcr-1基因的携带率较低(0.1%～10%)[35-36]。2017年我国政府做出严格禁止黏菌素作为畜牧生产的增长促进剂的决定[37]。

mcr-1已成为大量GNB对多黏菌素耐药性传播的一个重要原因[13，17，27]。mcr-1可在不同菌株间传播，包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、阪崎肠杆菌、沙门菌、弗氏柠檬酸杆菌、柠檬酸杆菌、宋内痢疾和莫拉菌[13，38]，也可在农场动物的粪便、食物、环境样本中广泛传播[39]。2020年，mcr-10在细菌Enterobacter roggenkampii的质粒上得到鉴定，目前在GNB中共发现10个不同变异体[40]。已知的mcr基因的变异体见表1。

3 不同细菌的多黏菌素耐药机制

3.1肠杆菌科 肠杆菌科家族中对多黏菌素耐药性菌株较多，包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌、志贺菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌[54-55]，其主要耐药机制是通过添加阳离子基团L-Ara4N和(或)pEtN来修饰脂多糖实现[11-12]。

肺炎克雷伯菌染色体耐药机制主要是由mgrB基因介导。mgrB基因的失活或缺失引起phoPQ操纵子过表达，进而激活pmrHFIJKLM操纵子，促进L-Ara4N 生物合成，增加其黏菌素耐药性[23]。肺炎克雷伯菌另一个多黏菌素耐药机制是表面阴离子荚膜多糖的过表达[24]，产生的保护性屏障阻碍了多黏菌素与脂质A的结合。

在大肠埃希菌中，mgrR是其对多黏菌素耐药的遗传决定因素[56]。mgrR通过将pEtN添加到脂多糖中实现对多黏菌素的耐药。在沙门菌中，mig-14基因可以通过降低生物体外膜的渗透性，支持生物膜形成来影响多黏菌素耐药性[57]。而在鼠伤寒沙门菌中，lpxM可以调节脂质A的酰化作用，其失活可导致L-Ara4N修饰缺失，降低多黏菌素的耐药性。

除上述染色体基因改变外，肠杆菌科细菌是可移动多黏菌素耐药基因的第一个储存库，2015年11月首次在动物来源大肠埃希菌菌株中发现了质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1[27]。迄今为止，大肠埃希菌仍是mcr阳性分离株中最流行的物种，占携带mcr分离株总数的90%以上，其次是肠沙门菌(7%)、肺炎克雷伯菌(2%)[58]。截至2019年，mcr在已在全球47个不同国家均有报道，广泛分布于动物、水、食物和生存环境中[39，58]。

3.2鲍曼不动杆菌 与其他肠杆菌科细菌相比，鲍曼不动杆菌缺乏用于L-Ara4N生物合成所有必需基因[13]。Adams等[59]研究显示，鲍曼不动杆菌的黏菌素耐药性与pmrA和pmrB基因有关。pmrA和pmrB基因突变引起pEtN加入脂多糖中，降低外膜的负电荷，阻碍多黏菌素与细菌的结合，产生耐药性。对黏菌素耐药的鲍曼不动杆菌菌株也可通过PmrA/B突变下调操纵子PmrCAB表达，降低其耐药性。

另外，在鲍曼不动杆菌中鉴定出生物素、lpxA、lpxC和lpxD基因与多黏菌素耐药性关系密切。生物素、lpxA、lpxC和lpxD是脂质代谢的重要辅助因子，生物素水平不足或lpxA、lpxC和lpxD基因突变可影响脂质A的生物合成，是鲍曼不动杆菌中多黏菌素耐药性相关的因子[3，13]。而较高的生物素水平导致脂质A的产生增加，可降低鲍曼不动杆菌对黏菌素的耐药水平[60]。另据Bojkovic等[61]研究揭示，LptD是新合成的脂多糖插入到外膜所必要的成分，去除lptD基因可导致鲍曼不动杆菌脂多糖完全缺失，引起多黏菌素耐药性降低。

对鲍曼不动杆菌，常规染色体编码多黏菌素耐药性的传播力有限。然而，近年在鲍曼不动杆菌中发现了质粒携带的mcr基因：在捷克共和国鲍曼不动杆菌中检测到了mcr-4[62]，在巴基斯坦鲍曼不动杆菌中检测到了mcr-1[63]以及在中国[52]和巴西[64]等地检测到mcr-4.3。这种基因型分布和耐药机制的发现对鲍曼不动杆菌对多黏菌素的耐药性研究至关重要。

3.3铜绿假单胞菌 铜绿假单胞菌的耐药性由5个调节脂多糖修饰的双组分系统介导，除PmrAB和PhoPQ的双组分系统外，还涉及ColR/ColS、ParR/ParS和CprRS三个双组分调控系统[24]。在细胞外Zn2+过量的情况下，ColR/ColS双组分调控系统上调，将PEtN添加到脂质A中，从而引起黏菌素耐药性[10]。

与鲍曼不动杆菌类似，铜绿假单胞菌中lpxC或lpxO2基因的突变也可导致脂质A的生物合成障碍，使多黏菌素作用靶点丢失，导致对多黏菌素耐药性增高[3]。此外，在细胞膜Mg2+水平降低的情况下，外膜蛋白OprH(或H1)过表达并与带负电荷的磷酸基团相结合，阻碍多黏菌素的结合，产生耐药性[65]。Perez等[65]揭示多黏菌素耐药性也可能通过产生过多荚膜而发生。

在质粒介导的黏菌素耐药方面，人们首次在美国马里兰州地区铜绿假单胞菌中检测到mcr。2018年，Snesrud等[66]通过全基因组测序发现了铜绿假单胞菌中编码mcr-5的染色体中携带黏菌素不敏感的转座子。2019年在对巴基斯坦地区铜绿假单胞菌多黏菌素耐药性调查中也检测到mcr-1阳性的分离菌株[64]。铜绿假单胞菌中mcr基因的起源、可传播性和流行性仍有待进一步鉴定。

4 展 望

GNB是引起临床感染的常见病原体，如碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌等多重耐药微生物感染越来越受到人们的关注。新型抗菌药物研发迟缓，促使黏菌素再次成为人们治疗多重耐药GNB的重要选择。然而畜牧业和农业中黏菌素的广泛滥用使其耐药菌株在世界范围内出现，这大大损害了黏菌素的功效。特别是质粒携带的mcr耐药基因的跨物种传播，已成为全世界的公共卫生和临床管理领域关注的热点和焦点问题。因此，应加强抗生素耐药基因的检测，同时加强相关专家之间的跨学科交流与合作，有效制止黏菌素在农业、畜牧业及临床上的滥用，严格控制细菌耐药性的进一步传播，同时制订政策引导，加大新型抗生素的研发投入力度。