OPO酶法合成和其在婴幼儿配方乳粉中的检测研究进展

安雪征 吕林燚 祁娜 杜旷 张双 杜鉴 齐原 田云翼

母乳是婴儿最理想的食物，母乳中含有3%-4%的脂肪，这些脂肪可为婴儿提供60%左右的能量，并对婴幼儿的生长发育起到非常重要的作用。但因社会环境等原因，我国母乳喂养率较低，于是很多家庭便选择母乳替代物——婴幼儿配方乳粉来喂养婴儿。但由于普通的婴幼儿配方乳粉多以牛乳脂肪和植物油为油脂配料，其2位棕榈酸酯（Sn-2棕榈酸酯）含量与其在母乳中的含量存在较大差异，从而导致婴幼儿对普通配方乳粉的营养吸收和消化能力不及母乳。为了更好地顺应宝宝自然的营养需求，在配方乳粉中添加1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（又称OPO结构脂）可以使配方乳粉中的Sn-2位棕榈酸酯的含量更接近母乳，有益于婴幼儿的生长发育。因此，研究如何生产OPO并将其作为人乳脂肪替代品应用于婴儿配方奶粉的生产中有着十分重要的意义。目前，酶促合成法因其温和的反应条件和较低的成本，成为合成OPO的主要方法。本文回顾了近年来使用酶促合成法生产OPO的研究，并着重讨论了OPO的结构与对婴儿的益处、OPO的合成工艺和影响因素，以及OPO的检测方法。

一、 OPO的结构与功能

母乳脂肪中98%为甘油三酯，这些甘油三酯多以Sn-USU形存在，其中U代表不饱和脂肪酸（多为油酸和亚油酸），S代表饱和脂肪酸（多为棕榈酸）。母乳中约80%的棕榈酸在Sn-2位点。在消化吸收甘油三脂的过程中，Sn1，3位点的脂肪酸会经酶水解后以游离脂肪酸的形式被吸收，Sn-2位点的脂肪酸则以甘油单酯的形式通过淋巴系统被人体吸收。普通配方乳粉中的脂肪结构与母乳中的脂肪结构存在差异，棕榈酸主要位于Sn1，3位点，这对婴儿对营养的消化吸收有负面影响。在消化过程中，Sn1，3位的棕榈酸经酶水解变为游离棕榈酸，游离的棕榈酸与钙离子等在小肠的酸性条件下会发生皂化反应，产生高熔点的不溶性物质，从而降低人体对脂肪酸的吸收率。这不仅会造成能量和钙的双重流失，还会形成不溶性物质，增加婴儿粪便的硬度，导致婴儿在生长过程中出现便秘等肠道疾病问题。图1为母乳和普通婴幼儿配方乳粉中脂肪代谢过程。

OPO为USU型酯的代表，其中Sn-1和Sn-3位为油酸，Sn-2位为棕榈酸。通过在乳粉中添加OPO，使配方乳粉中的Sn-2位棕榈酸的含量更接近母乳，能达到提高婴幼儿对营养和能量吸收率的效果，并能通过降低体内游离棕榈酸含量减少体内的钙、镁等骨骼矿物质的流失，在支持骨骼生长发育的同时有效降低不溶性物质的形成。研究表明，与喂养普通配方乳粉的婴儿相比，喂养添加OPO的婴儿配方乳粉可以降低婴儿粪便中的钙皂含量，降低婴儿粪便硬度，改善婴儿肠道菌群，减少婴儿的哭闹次数和时间。

二、OPO的合成工艺

OPO可以通过化学催化和酶催化两种方式生产。比起化学催化合成法，酶促合成法具有更高的选择性并可以在更温和的反应条件下进行，且由于化学催化合成法中额外的纯化步骤和更高的反应温度会提高生产OPO的成本，因此目前应用较广的OPO合成方法主要为酶促合成法。

sn-1，3特异性脂肪酶是用于酶促生产OPO的催化剂。已经有很多种类的sn-1，3特异性脂肪酶被研究用于以各种富含棕榈酸的脂肪或富含油酸的油脂为原料生产OPO，包括Lipozyme IM-60，Lipozyme TL IM，Lipozyme RM IM，Candida sp. 99∶125脂肪酶，Aspergillus oryzae脂肪酶等。酶促合成OPO涉及到的反应类型包括酸解、酯交换和醇解。

1.OPO酶促合成法的不同类型及反应特点。（1）酶促酸解法。酶促酸解法主要是以富含Sn-2位棕榈酸的油脂和游离脂肪酸油酸为底物，在脂肪酶的作用下生成OPO的过程，合成路线如图2所示。在此工艺中，以富含Sn-2位棕榈酸的油脂作为反应底物，较为常见的是棕榈酸硬脂、棕榈油、巴沙鲶鱼油、猪油等。李昕倩等使用猪油和油酸为反应底物，通过正交试验，使用Candida sp.99-125脂肪酶进行酸解反应合成OPO。在最优条件下，即底物质量比为1∶2（猪油∶油酸）、酶用量为10%，在40℃反应4h，得到的产物中OPO含量在43%以上。邹硕等以分提后富含三棕榈酸甘油酯的棕榈酸硬脂和油酸为反应底物，在脂肪酶 NS40086的作用下进行酸解合成OPO，在最优条件下，即底物摩尔比1∶10（分提后富含三棕榈酸甘油酯的棕榈酸硬脂∶油酸）、酶用量12%，在60℃反应4h，得到的产物中OPO含量为72.53%。李世磊等使用棕榈硬脂和油酸为反应底物，使用Lipozyme RM IM脂肪酶进行酸解合成OPO，在最优条件下，即底物摩尔比1∶10（棕榈硬脂：油酸）、酶用量10%，在56℃反应4h，得到的产物中OPO含量为45.23%。

（2）酶促酯-酯交换法。酶促酯-酯交换法以两种甘油三脂或者一种甘油三脂和酰基脂为原料，在脂肪酶的作用下生成OPO，合成路线如图3所示。虽然此方法可使用的底物来源广泛且反应成本较低，但会得到较复杂的产物，增加了分离OPO的难度。Lee等以含有三棕榈酸甘油酯纯度为92%的油脂和油酸乙酯为底物，在优化条件下，即底物摩尔比为5.5∶1（油酸乙酯：含有三棕榈酸甘油酯纯度为92%的油脂），在50℃下反应3h，得到OPO含量为31.43%的产物，酰基转移率最低为6.07%。张仁伟等以三棕榈酸甘油酯和不同的油酸酰基供体为底物，摩尔比1∶6（三棕榈酸甘油酯：油酸酰基供体）经Novozym 40086脂肪酶催化，在50℃下反应24h，得到了使用不同酰基生产OPO的产率，油酸乙酯作为供体时OPO的产率（37.54%）大于油酸甲酯作为供体时OPO的产率（34.56%），大于游离油酸作为供体时OPO的产率（32.11%）。这与Srivastava等以三棕榈酸甘油酯和油酸或油酸甲酯為底物，经脂肪酶Lipozyme RM IM作用下合成OPO的结果一致，即与油酸相比，油酸甲酯更适合作为酰基供体。宗蕾等以油酸乙酯和棕榈硬脂为底物经Novozym 40086脂肪酶催化，在最优条件下，即底物摩尔比1∶6（棕榈硬脂：油酸乙酯）、加酶量为8%，在60℃下反应1h，得到OPO含量为46.30%的产物。

（3）酶促醇解法。酶促醇解法以富含Sn-2位棕榈酸较多的油脂和乙醇为反应底物，在Sn-1，3特异性脂肪酶作用下醇解，得到含有较多棕榈酸在Sn-2位的甘油单酯，所得中间产物再和游离脂肪酸发生酯化反应生成OPO，合成路线如图4所示。与酸解法和酯-酯交换法相比，醇解法制备OPO会得到较少的副产物，并且可以提升OPO的纯度和产率，但是因为需要对醇解反应后得到的棕榈酸单甘酯进行分离纯化，因此合成成本较高。Pfeffre等在脂肪酶CalB的催化下，通过三棕榈酸甘油酯和乙醇醇解得到2-棕榈酸单甘酯，经溶剂结晶法获得纯度较高的Sn-2棕榈酸单甘脂，再将其与油酸进行酯化反应最终得到OPO（产率90%，纯度为95%）。张艳以三棕榈酸甘油酯和无水乙醇作为底物，摩尔比为1∶10，Candida sp.99-125脂肪酶添加量为15%，在45℃下醇解22h，再将纯化的棕榈酸单甘酯与油酸作为酯化底物，摩尔比为1∶4，Candida sp.99-125脂肪酶用量9%，在38℃反应下反应2h（反应到1.5h时补加油酸），得到OPO含量占甘油三酯的88.75%。

2.OPO酶促合成的影响因素。在合成OPO的过程中，脂肪酶的选择及活性、反应底物及配比、生物反应器等多方面因素都会对OPO的合成效率、产率和纯度造成影响。

（1）反应参数。反应过程中许多参数会影响OPO的产率和纯度，其中比较重要的包括反应温度、反应pH、反应时间和底物摩尔比。OPO的产率是多种反应参数共同决定的，现有的文献中也很少有单一反应参数对OPO产率影响的研究。根据使用的脂肪酶和反应系统的不同，获得最大的OPO产率所需要的反应参数的组合也不同。Chen等使用lipase Novozym 435作为催化剂，发现OPO计算产率在反应温度为50℃时最高，反应温度为40℃时次高，反应温度为30℃时最低，且OPO的产率随反应时间增长而增加。Gu等使用响应面分析法发现，当以Aspergillus oryzae lipase为催化剂使用填充床合成富含OPO的甘油三酯时，最佳的反应参数组合为：停留时间3小时、温度62.09℃、底物摩尔比7.13∶1（油酸∶棕榈硬脂）。Esteban等使用Lipase DF催化合成OPO，发现底物摩尔比为6∶1（富含油酸的游离脂肪酸混合物∶富含棕榈酸的甘油三酯）时OPO的产率高于底物摩尔比为4∶1和3∶1时OPO的产率。当反应在溶液中进行时，反应的温度为37℃，而没有溶剂时反应需要在50℃下进行才能达到同样的产率，且脂肪酶的用量更高。

合成OPO的反应体系是否包含溶剂也会影响反应中适合使用的脂肪酶的类型和最佳底物比。Wei等在研究中发现Lipozyme TL IM更适合有溶剂的反应体系，而Lipozyme RM IM更适合无溶剂的反应体系。有溶剂时最佳底物摩尔比为8∶1（油酸∶三棕榈酸甘油酯），而无溶剂时最佳底物摩尔比是6∶1（油酸∶三棕榈酸甘油酯）。

Zheng等使用Candida lipolytica lipase合成OPO并探究了反应温度、反应时间、底物摩尔比等反应参数对OPO产率的影响，最终优化了反应条件，使产品中OPO含量达到了46.5%。优化后的反应条件为：反应温度50℃、反应时间2h、底物摩尔比6∶1（油酸∶三棕榈酸甘油酯）、反应体系含水量2%、酶用量20mg/mL。其中，合成OPO的反应时间需要严格控制。过短的反应时间会使油酸的掺入率过低，而过长的反应时间与酰基转移的发生有关，进而影响产物的纯度。Lee等使用响应面分析法发现，当反应温度为50℃、反应时间为3h以及底物摩尔比为5.5∶1（油酸乙酯：含有三棕櫚酸甘油酯纯度为92%的油脂）时可以在最大化提高OPO含量的同时发生最少的酰基转移。

合成OPO时，反应体系的pH也会对产率产生影响，因为不同脂肪酶表现出最大活性的pH不同。真菌来源的脂肪酶表现出最大活性的pH范围为中性或者微酸性，而细菌来源的脂肪酶表现出最大活性的pH范围为中性或者微碱性。

（2）酶固定化载体材料。在研究和工业生产中很少将游离酶作为催化剂使用，因为比起固定化酶，游离酶更易变性、寿命短、稳定性低，且难以从反应系统中回收并再利用。目前已经有很多材料被用作酶的固定化载体，例如硅胶颗粒、大孔树脂、二氧化硅纳米颗粒、磁性碳纳米管等。

不同的材料对酶活性有不同的影响。比起固定在亲水性载体上，固定在疏水性载体材料上能让脂肪酶更好地发挥催化作用。Tecelao等探究了Accurel? MP 1000， Lewatit? VP OC 1600和Eupergit? C三种固定载体材料对Rhizopus oryzae lipase的影响。他们发现当酶固定在Accurel? MP 1000和Lewatit? VP OC 1600上时，油酸的掺入率最高，且固定在Lewatit? VP OC 1600上的酶拥有更长的半衰期。

（3）生物反应器。利用酶促反应生产目标结构的甘油三酯可以采用批处理和连续处理两种方式进行。批处理主要是在试管、烧杯或者搅拌釜式反应器等容器中分批次对样品进行处理。由于其设计比较简单，批处理过程中方便收集数据，所以在实验室生产中较为常见。连续处理中使用的生物反应器主要为填充床反应器，更适合工业规模生产。比起在填充床反应器中，酶促反应的速率在批处理中更快。但在填充床反应器中进行反应时，酶可以更好地被保护从而受到更少的机械损伤，而在搅拌釜式反应器中，酶会受到更多的机械损伤从而导致每个批次反应中酶活性的下降。Gu等在使用A. oryzae lipase合成OPO的研究中发现，脂肪酶在填充床反应器中进行反应时半衰期更长，为140h，而在反应釜式反应器中进行反应时，脂肪酶的半衰期只有24h。

三、乳粉中OPO的检测

近年来，我国陆续发布有关OPO作为营养强化剂的相关文件，强调了适用范围及用量。同时，随着OPO的生产制备工艺逐渐成熟，已有许多添加OPO的配方乳粉在市场上流通，但我国目前还未发布婴幼儿配方乳粉中OPO含量的国标检测方法，不过已经有很多研究人员尝试使用高效液相色谱法、气相色谱法和气相色谱-质谱联用等方法检测乳粉中的OPO，这些方法可以对未来国标方法的建立提供技术支持。

张雪通过气相色谱法使用十七烷酸甘油三酯标准物质作为内标，使用DB-1HT色谱柱、氢火焰离子化检测器对已知OPO含量的婴幼儿配方乳粉中的OPO含量进行检测。首先对样品进行水解（65℃-70℃，15min），然后使用乙醇、乙醚和石油醚对乳粉中的脂肪进行三次提取。旋转蒸发溶剂后，使用正己烷溶液定容样品。该方法的线性范围为0.1-0.5g/100g（r2=0.9999）;加标回收率在87.89%-98.65%之间;重复性试验得到的RSD为2.57%;检出限为0.041g/100g，定量限为0.136g/100g。木其尔等通过气相色谱法，以十七碳甘油三酯为内标，使用DB-1HT色谱柱、氢火焰离子化检测器对乳粉中OPO的含量进行测定。先对乳粉进行水解（65±1℃，15min），然后使用无水乙醚和石油醚对乳粉中脂肪进行两次提取，旋转蒸发醚溶液后，使用正己烷溶液定容样品。此研究中的线性范围为1-100 μg/mL（r2=0.997）;加标回收率在90.0%-96.12%之间（RSD<5%）;方法检出限为20μg/mg;定量限为70μg/mg;重复性试验得到的RSD为1.52%。陆雪龙等通过气相色谱法使用DB-1HT色谱柱、氢火焰离子化检测器对婴幼儿配方乳粉中的OPO含量进行检测。首先对样品进行水解（60℃，15min），然后使用无水乙醇、石油醚和乙醚通过离心法对脂肪进行两次提取。旋转蒸发溶剂后，使用正己烷溶液定容样品。该实验中，使用离心机对样品进行提取，与毛氏抽脂法和分液漏斗法相比，离心法在更好地分离醚溶液的同时也缩短了提取时间，提高了检测效率。此方法的线性范围为0.10-5.00mg/mL（r2=0.99955），加标回收率在90%-104%之间（RSD<5%）。

尚东洋等通过气相色谱-质谱联用仪（使用毛细管色谱柱HP-5MS），使用外标法对婴幼儿配方乳粉中的OPO进行了检测。先对样品进行水解（60℃，15-20min），然后对脂肪进行两次提取。旋转蒸发溶剂后，使用正己烷溶液定容样品。该实验的加标回收率为86.0%-94.7%（RSD<5%），准确度为1.73%。

经魏婷婷等实验证实，通过银离子色谱柱-液相色谱法配合蒸发光散射检测器可对甘油三脂的同分异构体进行分离并定量。杨贵芝通过此方法以正己烷-乙腈为流动相，对婴幼儿配方乳粉中的OPO含量进行了测定。首先按照准GB 5413.3-2010中的第一法对乳粉中的脂肪进行提取。设定漂移管温度为60℃、氮气流速为1.6L/min。该方法的线性线性范围为1.25-12.5g/kg （r2=0.9998）;回收率为82.8%-117%（RSD<10%）;检出限为0.35g/kg;定量限为1.2g/kg。宋戈等通过此方法以二氯甲烷-丙酮为流动相，对婴幼儿配方乳粉中的OPO进行了测定。先对乳粉进行水解（65 ±5℃，15-20min），然后使用乙醇、乙醚和石油醚通过离心对脂肪进行三次提取，随后经旋转蒸发除去溶剂，使用二氯甲烷定容。该方法设定漂移管温度为60℃、载气流速为1.6L/min。此方法的线性范围为1-1000mg/L（r2=0. 9998）;回收率为93.0%-101.5% （RSD<5%）;检出限为20mg/kg。与气相色谱法相比，银离子色谱柱-液相色谱法可对OPO和OPP这一类同分异构体进行有效分离并准确定量，但目前该方法所使用的银离子色谱柱的稳定性和使用率较低，对流动相的稳定性要求较高，检测所需时间较长。因此，对于液相色谱，如何在有效检测OPO含量的前提下，对银离子色谱柱的使用进行优化仍待研究。

四、结论与展望

婴幼儿配方乳粉作为母乳的替代品，目前已在市场廣泛流通。OPO作为婴幼儿配方乳粉中的营养强化剂，可通过优化配方乳粉的脂肪构成，促进婴幼儿对配方乳粉营养的吸收和消化。因此，添加OPO的婴幼儿乳粉具有巨大的市场潜力并将会成为未来母乳替代品中的主流产品。

目前OPO的主要制备方法是酶促合成法，但已有的大部分文献所描述的方法只局限于实验室中OPO的生产，因此如何扩大OPO的生产规模并建立适合商业化大规模生产的反应体系还有待进一步探究。同时，开发催化效率更高的脂肪酶以缩短反应的时间以及如何延长酶的使用寿命也有待更多的研究。

在乳粉中OPO的检测技术中，气相色谱法（气相色谱仪-DB-1HT色谱柱-氢火焰离子化检测器）和液相色谱法（液相色谱仪器-银离子色谱柱-蒸发光散射检测）均可准确检测出乳粉中OPO的含量，且均具有较高的稳定性。但还未有研究者对乳粉中OPO的各种检测技术以实验的方式进行过比对分析，因此，想要建立一个最佳的乳粉中OPO的检测方法并建立相关标准，还需要在该领域进行进一步的探究。

作者简介：安雪征（1985-），男，本科，中级工程师，研究方向为食品检验检测。

*通信作者：田云翼（1989-），男，硕士，中级工程师，研究方向为食品添加剂及配料。