乙型肝炎病毒感染母婴阻断疗效的影响因素及其与TNF-α-308基因多态性的关系

赵 姝，张 英，陈 晶，赵晓娟

(青岛市中心医院产科，山东 青岛 266042)

孕产妇母婴传播是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的重要传播途径，通过母婴传播的HBV感染者占HBV感染人群的30%以上[1]。感染HBV的新生儿超过90%会逐渐发展为HBV感染患者[2]，故孕期母婴阻断治疗对预防新生儿感染HBV有重要意义。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是人体炎症反应、免疫应答体系的重要参与因子，其基因多态性与HBV感染的发生密切相关[3]。研究表明机体TNF-α-308 G/A基因多态性影响体内TNF-α的转录、表达，当TNF-α-308位点为G变为A等位基因时，机体内TNF-α-308位点周围转录因子无法识别激活蛋白-2，影响TNF-α的表达[4]。目前，关于TNF-α-308基因多态性与HBV感染孕产妇母婴阻断治疗效果的研究报道较少，本研究选取104例HBV感染的孕产妇为研究对象，分析HBV感染母婴阻断疗效的影响因素及其与TNF-α-308基因多态性的关系，为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2018年7月至2019年12月青岛市中心医院收治的104例HBV感染母婴阻断治疗孕产妇为研究对象，根据治疗效果分为阻断失败组(21例)、阻断成功组(83例)，所有研究对象均符合以下纳入及排除标准。本研究经过医院伦理委员会审批通过。

纳入标准：①符合2019年版《慢性乙型肝炎防治指南》[5]中关于HBV诊断标准；②年龄大于20岁；③HBV DNA病毒载量大于2×105IU/mL且同意接受抗病毒药物干预；④自然妊娠、单胎、足月分娩；⑤自愿签署本研究知情同意书。排除标准：①重要脏器功能障碍者；②伴有急性感染、严重内外科疾病者；③伴有恶性肿瘤、酒精等造成的肝脏损伤者；④伴有免疫功能缺陷者；⑤存在认知或沟通障碍者；⑥近1个月内接受过抗病毒治疗者；⑦伴有甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染者；⑧入组患者之间具有亲缘关系者。

1.2 方法

1.2.1 母婴阻断治疗

所有研究对象参照《感染乙型肝炎病毒的育龄女性临床管理共识》[6]对所有HBV感染孕产妇自妊娠24～28周开始服用富马酸替诺福韦二吡呋酯或替比夫定抗病毒治疗。

1.2.2 TNF-α-308基因多态性检测

所有孕产妇分娩前均抽取静脉血液3mL，乙二酸四乙酸二钾抗凝用DNA纯化试剂盒提取，严格按照试剂盒使用说明操作。查询美国国立生物技术信息中心官网获取人类TNF-α基因序列，设计扩增TNF-α-308 G/A位点基因在荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪上扩增。PCR扩增方法：反应体系25μL：上下游引物各1μL、cDNA模板1μL，95℃预变性2min，95℃变性1min，62℃退火1min，75℃延伸1min，循环35次，最后一次75℃延伸5min，5℃终止反应，最后分离PCR扩增产物并进行TNF-α-308 G/A位点的等位基因及基因型鉴定。TNF-α上游引物为5′-AGGCCTAATCAGGTTTTCCAT-3′，下游引物为5′-TCCTGCTGCACTCCATTCG-3′。

1.2.3 血浆HBV病毒载量检测

所有孕产妇分娩前抽取空腹静脉血5mL，肝素抗凝，抗凝全血6h内进行离心处理(3 000r/min离心10min，离心半径12cm)，收集血浆，采用核酸提取仪(法国梅里埃Easy-MEG型)、病毒载量检测仪(瑞士罗氏TaqMan96型)、HBV病毒载量检测试剂盒(法国梅里埃公司)、PCR仪(瑞士罗氏LightCycler 96型)进行实时荧光定量测定HBV DNA病毒载量，试验严格参照说明书标准操作。

1.3 观察指标

①母婴阻断疗效。婴儿完成主被动免疫(婴儿出生6h内、出生15d分别注射200IU乙型肝炎免疫球蛋白，出生24h内、出生后1个月、出生后6个月分组注射重组酵母乙肝疫苗10μg)，之后于7月龄时采集外周血，HBsAg阳性、HBV DNA阳性(伴或不伴HBeAg阳性)则记为阻断失败，否则记为阻断成功[7]。②比较阻断成功组和阻断失败组临床资料，包括年龄、孕前体质量指数(body mass index，BMI)、产次、抗病毒治疗药物类型、分娩方式、HBV感染病程、产后是否停药、母乳喂养情况，产后谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)水平、C反应蛋白(C-reaction protein，CRP)含量、外周血白细胞计数、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-4、IL-18，分娩前HBV基因型、乙型肝炎e抗原(Hepatitis B e antigen，HBeAg)、乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)、血浆HBV病毒载量、TNF-α-308基因多态性及新生儿合并口腔溃疡情况等。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组临床资料比较

阻断失败组孕前BMI、ALT、C反应蛋白、IL-6、IL-4、HBeAg、HBsAg、HBV DNA病毒载量均显著高于阻断成功组(P<0.05)，而IL-18显著低于阻断成功组(P<0.01)。两组患者其余临床资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组患者临床资料比较Table 1 Comparison of clinical data of the patients between the two groups

2.2 TNF-α-308 G/A位点基因型频率、等位基因频率与HBV感染母婴阻断失败的关系

TNF-α-308 G/A位点基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡检验(P>0.05)，具有群体代表性。阻断失败组TNF-α-308 G/A位点A等位基因频率表达显著高于阻断成功组(P<0.05)，见表2。

表2 TNF-α-308 G/A位点基因型频率、等位基因频率与HBV感染母婴阻断失败的关系[n(%)]Table 2 Relationships of genotype frequency and allele frequency of TNF-α-308 G/A locus with failed mother-to-child transmission blocking of HBV infection[n(%)]

2.3 影响HBV感染孕产妇母婴阻断失败的多因素分析

以HBV感染孕产妇母婴阻断是否失败为因变量(成功=0，失败=1)，孕前BMI、ALT、CRP、IL-6、IL-4、HBeAg、HBsAg、HBVDNA病毒载量、IL-18、TNF-α-308 G/A位点A等位基因频率为自变量，并将上述自变量赋值为连续变量进行Logistic回归分析，多因素分析显示HBV DNA病毒载量高、TNF-α-308 G/A位点A等位基因频率是HBV感染孕产妇母婴阻断失败的危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 影响HBV感染孕产妇母婴阻断失败的多因素分析Table 3 Multiple factor analysis of failed mother-to-infant trasmission blocking of HBV infection

3 讨论

HBV母婴垂直传播是家族聚集性HBV感染的重要原因，感染者发生肝硬化、肝癌的风险明显增加，且发病年龄逐代提前[8]。我国HBV携带者约40%为女性，部分地区孕产妇HBsAg阳性率可高达10%左右[9]。因此，尽早对HBV感染孕产妇母婴阻断情况进行判断，及时开展诊疗措施对改善预后意义重大。

3.1 HBV感染孕产妇母婴阻断疗效的影响因素

本研究结果发现阻断失败组孕前BMI、ALT、CRP、IL-6、IL-4、HBeAg、HBsAg、HBV DNA病毒载量均显著高于阻断成功组(P<0.05)，而IL-18显著低于阻断成功组(P<0.01)，且阻断失败组TNF-α-308 G/A位点A等位基因频率表达显著高于阻断成功组(P<0.05)。多因素分析结果显示HBV DNA病毒载量高、TNF-α-308 G/A位点A等位基因频率是HBV感染孕产妇母婴阻断失败的危险因素(P<0.05)，提示HBV DNA病毒载量、TNF-α-308 G/A位点A等位基因频率与HBV感染孕产妇母婴阻断失败有关。研究表明随着母亲HBV DNA病毒载量的增高，其分娩的新生儿接种HBV疫苗后出现免疫失败的风险也随之提高，即HBV感染孕产妇HBV DNA病毒载量越高，母婴阻断失败的发生率也明显增高[10]，与本研究结果类似，共同证实HBV感染孕产妇HBV DNA病毒载量与HBV感染孕产妇母婴阻断失败相关。在HBV感染过程中TNF-α的表达与HBV感染患者病毒载量、HBeAg等密切相关，当机体TNF-α-308位点由G变为A等位基因时，机体内TNF-α-308位点周围转录因子无法识别激活蛋白-2，TNF-α转录效率增加7倍左右，造成患者体内TNF-α表达异常，影响HBV感染后对病毒的清除作用。

3.2 TNF-α-308基因多态性与HBV感染孕产妇母婴阻断失败的关系

TNF-α是激活细胞因子体系的启动因子，是诱导机体炎症反应的重要介质，当机体组织发生损伤、感染等不良事件后，TNF-α在人体循环中迅速高表达，使人体内细胞级联效应被激活，导致过度炎症，使炎性细胞活化，加剧炎性反应，导致或加剧机体感染事件的发生[11]。本研究TNF-α-308 G/A位点基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡检验，具有群体代表性。TNF-α-308基因多态性可能是通过机体激活蛋白-2与TNF-α基因的结合对其转录情况产生影响，激活蛋白-2具有明显抑制TNF-α启动因子活性的作用，进而影响TNF-α的表达，TNF-α-308位点长10bp的DNA片段可使激活蛋白-2得识别序列被激活，当TNF-α-308位点等位基因为G，激活蛋白-2可有效识别序列并相互结合，使TNF-α启动因子的活性受到抑制，抑制TNF-α的表达，但当机体TNF-α-308位点由G变为A等位基因时，激活蛋白-2无法识别序列，进而影响TNF-α的表达，影响机体对HBV病毒的清除作用，增加了HBV感染孕产妇母婴阻断失败的风险[12]。

综上所述，TNF-α-308基因多态性与HBV感染孕产妇母婴阻断失败相关，HBV DNA病毒载量高、TNF-α-308 G/A位点A等位基因频率是HBV感染孕产妇母婴阻断失败的危险因素，但结果仍需多中心大样本研究进一步验证。